La nouvelle frontière des analyses de nitrosamines : détection et évaluation des risques dans les emballages et les poches de perfusion intraveineuse

L'analyse des nitrosamines continue de pousser les laboratoires d'analyse vers de nouveaux niveaux de sensibilité, tandis que l'évolution du cadre réglementaire élargit le débat au-delà des tests traditionnels. Alors que l'attention se porte désormais sur d'autres espèces N-nitroso (c'est-à-dire les o-NNO) et sur les substances extractibles et lixiviables (E&L) potentielles provenant des matériaux d'emballage, tels que les poches de perfusion, les laboratoires sont confrontés à de nouveaux défis en matière de détection, de quantification et de développement de méthodes.

Lors d'un récent webinaire, Jason Brown, expert en nitrosamines chez Brown Pharma Consulting, s'est entretenu avec le Dr Marian Twohig, scientifique-conseil chez Waters, afin d'analyser cette évolution du secteur. Des nouvelles considérations relatives aux nitrosamines et de leur lien avec les critères E&L aux stratégies pratiques de LC-MS/MS permettant de respecter les limites strictes fixées pour les petites nitrosamines dialkyliques, ils ont passé en revue le parcours du secteur, les défis auxquels les laboratoires sont confrontés aujourd'hui et les perspectives d'avenir.

Cet article poursuit la discussion en répondant à certaines des questions posées par les participants lors du webinaire.

Q : Pourriez-vous nous donner davantage de détails sur l'utilisation d'une colonne à retard et sur son incidence sur le temps de rétention, la pression et la compatibilité avec une colonne analytique ?

A : The retention properties of the delay column doivent être égales ou supérieures à celles de la colonne analytique afin de garantir un retard suffisant du composant interférant, empêchant ainsi la co-élution avec l'analyte. La différence globale de temps de rétention observée après l'ajout de la colonne de retard au circuit d'écoulement sera proportionnelle au volume de la colonne à lit fixe, au volume des tubulures de raccordement et au débit de la pompe.¹ La différence de pression observée dépendra également des composants ajoutés. Dans les détails expérimentaux décrits lors du webinaire, la colonne à retard présentait une taille de particules de 5 µm, des dimensions de 2,1 x 50 mm et un débit expérimental de 300 µL/min, ce qui a porté la pression de la méthode à moins de 6 000 psi. La pression ajoutée restait largement en deçà de la pression maximale de la pompe UHPLC analytique, qui est de 15 000 psi.

Q : Pour l'extraction des nitrosamines contenues dans les poches de perfusion, comment déterminez-vous le volume d'échantillon à utiliser pour l'extraction ?

R : Dans cette version de l'étude, nous avons analysé les solutions contenues dans les poches de perfusion dans leurs conditions d'utilisation prévues, ce qui a permis de détecter des concentrations faibles (en ng/mL) de nitrosamines à petites molécules^.² Si les volumes d'application des solutions contenues dans les poches de perfusion sont élevés, une étape de concentration pourrait s'avérer nécessaire pour atteindre la sensibilité requise afin de respecter les limites réglementaires. Dans ce cas, une extraction par phase solide (SPE) ou une extraction liquide-liquide pourrait être utilisée pour concentrer les nitrosamines cibles, garantissant ainsi que le niveau de sensibilité requis soit atteint par le détecteur utilisé pour l'analyse.

Les nitrosamines à petites molécules présentent des degrés de polarité variables. Par conséquent, la chimie de la SPE utilisée doit permettre de retenir toutes les nitrosamines et d'assurer un bon taux de récupération dans le cadre de la méthode d'analyse.

Q : Auriez-vous des suggestions pour améliorer la rétention des nitrosamines polaires dans la méthode d'analyse ?

R : Pour garantir la robustesse d'une méthode d'analyse des composés polaires par chromatographie liquide en phase inverse (RPLC), l'analyte cible doit présenter un facteur de rétention (k′) d'au moins 1,0 afin d'assurer une séparation adéquate par rapport au volume vide de la colonne. Idéalement, il convient d'atteindre une valeur de k′ égale ou supérieure à 2,0 afin d'améliorer la rétention et la robustesse de la méthode.

Le facteur de rétention, également appelé facteur de capacité (k′), mesure le degré de rétention d’un analyte sur la colonne chromatographique. Il reflète le temps que l’analyte passe à interagir avec la phase stationnaire par rapport à la phase mobile. Des valeurs de k′ plus élevées indiquent des interactions plus fortes avec la phase stationnaire, ce qui se traduit par une rétention accrue. Comme k′ décrit la position d’élution d’un analyte par rapport au volume vide, il s’agit d’un paramètre utile pour évaluer le risque d’interférence provenant des composants de la matrice ou d’autres composés qui s’éluent à proximité du volume vide et peuvent affecter la détection de l’analyte.

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour augmenter la rétention des analytes. Le choix d'une phase stationnaire présentant des caractéristiques de rétention polaire améliorées s'avère souvent avantageux. On peut citer, par exemple, les colonnes spécialement conçues pour les analytes polaires, telles que Waters XSelect HSS T3, Atlantis Premier BEH_C18 AXet Colonnes CORTECS T3. Ces phases peuvent permettre une meilleure rétention des composés polaires, y compris dans des conditions où la phase mobile est très aqueuse.

La mise au point de la méthode doit commencer par une réduction de la proportion de solvant organique dans la phase mobile. Lorsque la composition chimique de la colonne le permet, l'utilisation d'une phase 100 % aqueuse peut favoriser davantage la rétention des analytes polaires. Un rééquilibrage adéquat de la colonne est également essentiel ; il est recommandé de laisser s'écouler au moins 10 volumes de colonne dans les conditions initiales de la phase mobile entre chaque injection.

L'obtention d'une rétention suffisante améliore la robustesse de la méthode en garantissant que l'analyte est bien séparé du volume vide, ce qui réduit ainsi l'impact potentiel des interférences à élution précoce sur la sensibilité, la précision et la reproductibilité de l'analyte. Si une rétention acceptable ne peut être obtenue pour les nitrosamines cibles à l'aide de la RPLC, d'autres mécanismes de rétention doivent être envisagés. Par exemple, la chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) peut offrir une rétention et une sélectivité améliorées pour les composés hautement polaires.

Q : Comment avez-vous déterminé les rapports ioniques acceptables à utiliser pour la méthode finale ? Le logiciel permet-il de surveiller ces rapports lors des analyses de routine ?

A : waters_connect for Quantitation Software peut être configuré pour mesurer et surveiller les rapports ioniques MRM. Les rapports ioniques MRM attendus peuvent être spécifiés dans la méthode de traitement ou, à défaut, des étalons de référence peuvent être désignés dans la liste des échantillons et utilisés pour calculer automatiquement les rapports ioniques attendus. Des ensembles de règles sont configurés dans le logiciel et servent à signaler lorsque les paramètres des résultats, y compris les rapports ioniques MRM, se situent en dehors des critères d’acceptabilité spécifiés pour un composant. Dans l’ensemble de règles, les tolérances appliquées au rapport ionique mesuré par rapport au rapport ionique attendu sont spécifiées. Si un échantillon produit des pics en dehors des tolérances spécifiées, il sera signalé (composant par composant) comme présentant une anomalie. La colonne « Vérification des rapports ioniques » est visible dans le tableau récapitulatif des données, ainsi que le statut « conforme/non conforme » attribué aux composants détectés.

Q : Avez-vous eu des échanges avec les autorités de régulation concernant l'utilisation des colonnes de retard ?

R : Nous n'avons pas abordé la question de l'utilisation d'une colonne de retard avec les autorités réglementaires. L'utilisation d'une colonne de retard a été intégrée à la stratégie de mise au point de la méthode afin de permettre l'élimination d'un pic interférant éluant au même temps de rétention et générant un signal à chaque transition MRM du NDBA, ce qui aurait entraîné une ambiguïté dans la détection du NDBA dans le dosage final.

Q : L'agence accepte-t-elle les justifications visant à relever les limites maximales fixées pour la NDBA dans les préparations parentales à fort volume, sur la base d'une évaluation toxicologique et d'une stratégie d'exposition à vie ?

R : Au moment de l'enregistrement, non. Cependant, une récente recommandation de la FDA a modifié cette position. Ainsi, les ajustements des limites « inférieures à la durée de vie » sont désormais acceptés. Cela doit être effectué produit par produit et en fonction de la durée du traitement. Pour être clair, cette recommandation s'applique à tous les médicaments commercialisés, et pas uniquement aux médicaments administrés par voie parentérale.³

Q : Si mon laboratoire effectue déjà des analyses de nitrosamines, pouvons-nous également réaliser des analyses E&L ? Quels sont les produits et procédés réellement concernés ?

R : Les compétences spécifiques requises pour réaliser une analyse non ciblée diffèrent considérablement de celles nécessaires à l'analyse ciblée des nitrosamines. De plus, bien qu'il y ait un certain chevauchement au niveau des équipements, celui-ci est rarement total. Cela vaut même pour les besoins en matière de spectrométrie de masse (MS), où des capacités spectrales complètes sont indispensables. Les efforts visant à make a typical MS lab into an E&L-specific lab sont difficiles à surmonter sans un budget important et des investissements considérables dans les analystes.

La question du champ d’application est très pertinente. Le nouveau projet de lignes directrices de la FDA sur les systèmes de fermeture des conteneurs (Container Closure System Guidance) a récemment élargi ce champ d’application^.⁴ Ainsi, toutes les substances médicamenteuses et tous les produits pharmaceutiques sont concernés. De plus, toutes les étapes du processus de fabrication des molécules de grande taille et des produits biologiques sont incluses. En substance, cela exclut uniquement les matières premières des excipients et la production de molécules de petite taille. J’espère que cela changera, car ce champ d’application repose sur certaines hypothèses avec lesquelles je ne suis pas d’accord, mais je ne m’attends pas à ce que cela change de sitôt. Gardez à l’esprit que même les éléments « relevant du champ d’application » doivent passer par les étapes d’identification et d’évaluation des risques. Ces deux étapes retirent des composants du flux de travail, ce qui conduit à des analyses en laboratoire.

Q : Quels tests devrions-nous/pouvons-nous/devons-nous demander à nos fournisseurs de matériaux d'emballage dans le cadre de l'évaluation des risques liés aux nitrosamines pour les comprimés, les sirops, les suppositoires et les produits injectables ?

R : À l'heure actuelle, on estime que le risque lié aux nitrosamines susceptibles de se libérer des emballages est entièrement lié à l'utilisation de nitrocellulose dans les étiquettes directement apposées sur l'emballage primaire et, là encore, qu'il se limite aux blisters et aux poches de perfusion. Certains ont suggéré d'inclure des questions concernant la présence potentielle de nitrosamines dans les demandes techniques adressées aux fournisseurs d'emballages et d'étiquettes. Dans le cadre d'une approche fondée sur les risques, cela se justifie aisément.

Q : Quels sont les risques liés à la formation de nitrosamines dans l'organisme ? Existe-t-il des recommandations à ce sujet ?

R : Il s’agit d’un sujet intéressant et complexe. Il existe indéniablement un risque réel et bien connu de formation de nitrosamines dans le tractus gastro-intestinal. Quelques études se sont penchées activement sur cette question. À ma connaissance, aucune étude exhaustive n’a été menée à l’aide des technologies modernes de LC-MS. Certes, le tractus gastro-intestinal présente tous les facteurs nécessaires à la nitrosation : température, pH et quantités de nitrites ; on y trouve également des amines primaires, qui réagissent de manière préférentielle avec les nitrites. J’ai dirigé il y a quelques années une étude de validation de principe qui a mis en évidence la formation à grande échelle de nitrosamines dans plusieurs milieux de dissolution biorelevants. Cependant, il est impossible de reproduire intégralement les complexités in vivo. Il convient également de noter que de nombreuses amines vulnérables sont présentes dans de nombreux aliments courants.

En résumé, il en faut bien plus pour bien cerner les risques pour le patient. Les facteurs liés à la composition de l'estomac, notamment les aliments, jouent un rôle important.

Q : Des articles récemment publiés ont mis en évidence l'impact des NOx sur la formation de nitrosamines à partir d'échantillons de petite taille, à l'échelle analytique. Cela a-t-il une incidence sur l'interprétation des données relatives à des matériaux en vrac à grande échelle ?

R : Rok Gharek et son équipe ont rédigé plusieurs excellents articles sur ce sujet, et j’ai eu l’occasion d’en discuter directement avec lui et l’un de ses coauteurs.^⁵ Une partie de l’étude a examiné comment les NOx saturaient différents niveaux d’un tube rempli d’un principe actif ou d’un excipient, afin de démontrer qu’il ne s’agissait pas uniquement d’une exposition en surface. Ils en ont conclu que, bien que le NOx puisse pénétrer en profondeur dans les différentes couches d’un récipient de vrac, le NOx présent était consommé par les couches les plus externes du vrac.

Honnêtement, un bon rééchantillonnage de la matière en vrac, à l'aide d'un échantillonneur permettant de prélever des échantillons dans la carotte, est la seule solution envisageable. Il faudrait envisager de mener des travaux en laboratoire afin de déterminer quels matériaux sont réellement exposés à un risque, car les articles cités ont montré que certains matériaux présentent un risque bien plus élevé que d'autres.

Regardez l'intégralité du webinaire pour en savoir plus sur l'évolution du paysage analytique en matière d'analyse des nitrosamines.

Nous tenons à remercier tout particulièrement Jason Brown, de Brown Pharma Consulting, pour son intervention lors du webinaire et pour l'aide qu'il nous a apportée en répondant à ces questions.

Références

1. The Use of a Delay Column to Mitigate Persistent Interference Peaks in the Trace Level Quantitation of NDBA in Normal Saline Intravenous Infusion Bags Using UHPLC-MS/MS
2. Identification and Quantitation of N-Nitrosamines in Normal Saline Intravenous Infusion bags Using UHPLC-MS/MS
3. Application de l'ajustement « inférieur à la durée de vie » aux impuretés de type nitrosamine
4. Systèmes de fermeture de récipients pour médicaments à usage humain et produits biologiques
5. Grahek, R., et al. (2026). « Les teneurs en nitrites des excipients ne sont pas des caractéristiques fixes des matières : formation de nitrites à partir des NOx présents dans l'environnement et implications pour la fabrication des médicaments. » Journal of Pharmaceutical Sciences 115(11).

Les opinions exprimées ici n'engagent que les auteurs principaux et les coauteurs, et ne reflètent pas le point de vue de Waters Corporation. Veuillez faire preuve de la diligence requise avant de prendre toute décision fondée sur les directives réglementaires.