La nueva frontera en el análisis de nitrosaminas: detección y evaluación de riesgos en envases y bolsas de infusión intravenosa

El análisis de nitrosaminas sigue impulsando a los laboratorios analíticos hacia nuevos niveles de sensibilidad, mientras que el cambiante panorama normativo está ampliando el debate más allá de los ensayos tradicionales. A medida que la atención se centra en otras especies N-nitrosas (es decir, las o-NNO) y en los posibles compuestos extraíbles y lixiviables (E&L) de los materiales de envasado, como las bolsas de suero, los laboratorios se enfrentan a nuevos retos en materia de detección, cuantificación y desarrollo de métodos.

En un seminario web reciente, Jason Brown, experto en nitrosaminas de Brown Pharma Consulting, se reunió con la Dra. Marian Twohig, científica consultora de Waters, para analizar este panorama en constante evolución. Desde las nuevas consideraciones sobre las nitrosaminas y su relación con la normativa E&L hasta las estrategias prácticas de LC-MS/MS para cumplir los exigentes límites establecidos para las nitrosaminas dialquílicas de bajo peso molecular, ambos analizaron la trayectoria del sector, los retos a los que se enfrentan hoy en día los laboratorios y lo que puede deparar el futuro.

En esta entrada del blog continuamos con el debate respondiendo a algunas de las preguntas que plantearon los asistentes durante el seminario web.

P: ¿Podría dar más detalles sobre el uso de una columna de retardo y su efecto en el tiempo de retención, la presión y la compatibilidad con una columna analítica?

A: The retention properties of the delay column debe ser igual o superior a las de la columna analítica para garantizar un retraso suficiente del componente interferente, evitando así la coelución con el analito. La diferencia total en el tiempo de retención observada tras añadir la columna de retraso al recorrido del flujo será proporcional al volumen de la columna de lecho empaquetado, al volumen del tubo de conexión y al caudal de la bomba.¹ La diferencia de presión observada también dependerá de los componentes añadidos. En los detalles experimentales descritos en el seminario web, la columna de retardo tenía un tamaño de partícula de 5 µm, con unas dimensiones de 2,1 x 50 mm y un caudal experimental de 300 µL/min, lo que situaba la presión del método por debajo de los 6.000 psi. La presión añadida se encontraba ampliamente dentro de la presión máxima de la bomba analítica de UHPLC, que es de 15.000 psi.

P: Para la extracción de nitrosaminas de las bolsas de suero, ¿cómo se determina el volumen de muestra que se va a utilizar para la extracción?

R: En esta versión del trabajo, analizamos las soluciones de las bolsas intravenosas en las condiciones de uso previstas, lo que permitió detectar nitrosaminas de moléculas pequeñas a niveles bajos de ng/mL^.² Si los volúmenes de aplicación de las soluciones contenidas en las bolsas intravenosas son elevados, podría ser necesario un paso de concentración para alcanzar la sensibilidad requerida que permita cumplir los límites reglamentarios. En este caso, se podría recurrir a la extracción por fase sólida (SPE) o a la extracción líquido-líquido para concentrar las nitrosaminas de interés, garantizando así que el detector utilizado para el análisis alcance el nivel de sensibilidad requerido.

Las nitrosaminas de molécula pequeña presentan diferentes grados de polaridad. Por lo tanto, la química de SPE utilizada debe ser adecuada para retener y garantizar una buena recuperación de todas las nitrosaminas en el método de ensayo.

P: ¿Tienes alguna sugerencia para mejorar la retención de las nitrosaminas polares en el método analítico?

R: Para el desarrollo de un método robusto para compuestos polares mediante cromatografía líquida de fase inversa (RPLC), el analito objetivo debe presentar un factor de retención mínimo (k′) de 1,0 para garantizar una separación adecuada respecto al volumen vacío de la columna. Lo ideal es alcanzar un valor de k′ de 2,0 o superior para obtener una mejor retención y una mayor robustez del método.

El factor de retención, también denominado factor de capacidad (k′), es una medida del grado en que un analito se retiene en la columna cromatográfica. Refleja el tiempo que el analito pasa interactuando con la fase estacionaria en relación con la fase móvil. Los valores más altos de k′ indican interacciones más fuertes con la fase estacionaria, lo que da lugar a una mayor retención. Dado que k′ describe la posición de elución de un analito en relación con el volumen vacío, es un parámetro útil para evaluar la probabilidad de interferencia por parte de componentes de la matriz u otros compuestos que se eluyen cerca del volumen vacío y que pueden afectar a la detección del analito.

Se pueden utilizar varios métodos para aumentar la retención del analito. A menudo resulta beneficioso seleccionar una fase estacionaria con características de retención polar mejoradas. Algunos ejemplos son las columnas diseñadas específicamente para analitos polares, como Waters XSelect HSS T3, Atlantis Premier BEH_C18 AXy Columnas CORTECS T3. Estas fases pueden ofrecer una mejor retención de los compuestos polares, incluso en condiciones de fase móvil altamente acuosa.

El desarrollo del método debe comenzar reduciendo la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil. Cuando la química de la columna lo permita, el funcionamiento en condiciones 100 % acuosas puede favorecer aún más la retención de los analitos polares. También es fundamental un reequilibrio adecuado de la columna, por lo que se recomienda un mínimo de 10 volúmenes de columna en las condiciones iniciales de la fase móvil entre cada inyección.

Lograr una retención suficiente mejora la robustez del método, ya que garantiza que el analito quede bien separado del volumen de vacío, lo que reduce el posible impacto de las interferencias de elución temprana en la sensibilidad, la precisión y la reproducibilidad del analito. Si no se consigue una retención aceptable para las nitrosaminas objetivo mediante RPLC, se deben considerar mecanismos de retención alternativos. Por ejemplo, la cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) puede proporcionar una mejor retención y selectividad para compuestos altamente polares.

P: ¿Cómo se determinaron las proporciones de iones adecuadas que se utilizarán en el método definitivo? ¿Ayuda el software a controlar estas proporciones en los análisis rutinarios?

A: waters_connect for Quantitation Software Se puede configurar para medir y supervisar las relaciones iónicas MRM. Las relaciones iónicas MRM esperadas pueden especificarse en el método de procesamiento o, alternativamente, pueden designarse patrones de referencia en la lista de muestras y utilizarse para calcular automáticamente las relaciones iónicas esperadas. Los conjuntos de reglas se configuran en el software y se utilizan para señalar cuándo los parámetros de los resultados, incluidas las relaciones iónicas MRM, se encuentran fuera de los criterios aceptables especificados para un componente. En el conjunto de reglas se especifican las tolerancias aplicadas a la relación iónica medida frente a la esperada. Si una muestra produce picos fuera de las tolerancias especificadas, se marcará (componente por componente) como una excepción. La columna «Comprobación de relaciones iónicas» puede verse en la tabla de resumen de datos junto con el estado de «aprobado/suspendido» aplicado a los componentes detectados.

P: ¿Habéis mantenido alguna conversación con las autoridades reguladoras sobre el uso de columnas de retardo?

R: No hemos tratado el uso de una columna de retardo con las agencias reguladoras. El uso de una columna de retardo se incluyó en la estrategia de desarrollo del método para permitir la eliminación de un pico interferente que eluía en el mismo tiempo de retención y aportaba una señal en cada transición MRM del NDBA, lo que habría provocado ambigüedad en la detección del NDBA en el ensayo final.

P: ¿Acepta la agencia las justificaciones para establecer límites de especificación más elevados para el NDBA en los productos parentales de gran volumen, basadas en la evaluación toxicológica y la estrategia de exposición a lo largo de toda la vida?

R: En el momento de la grabación, no. Sin embargo, una directriz reciente de la FDA ha modificado esa postura. Por lo tanto, ahora se aceptan los ajustes de los límites «inferiores a la vida útil». Esto debe hacerse producto por producto y en función de la duración del tratamiento. Para que quede claro, esta directriz se aplica a todos los medicamentos comercializados, no solo a los parenterales.³

P: Si mi laboratorio ya realiza análisis de nitrosaminas, ¿podemos realizar también análisis de E&L? ¿Qué productos y procesos entran realmente dentro del ámbito de aplicación?

R: Las habilidades específicas necesarias para realizar un análisis no dirigido difieren en gran medida de las que se requieren en el análisis dirigido de nitrosaminas. Además, aunque existe cierto solapamiento en cuanto al equipamiento, rara vez es total. Esto se extiende incluso a las necesidades de la espectrometría de masas (MS), donde es imprescindible disponer de capacidades espectrales completas. Los esfuerzos por make a typical MS lab into an E&L-specific lab son difíciles de superar sin un presupuesto elevado y una inversión considerable en los analistas.

El ámbito de aplicación es una cuestión muy importante. El nuevo borrador de la Guía sobre el sistema de cierre de envases de la FDA lo ha ampliado recientemente^.⁴ Por lo tanto, todas las sustancias farmacológicas y los productos farmacéuticos entran dentro de dicho ámbito. Además, también se incluyen todas las etapas del proceso de fabricación de moléculas grandes y productos biológicos. Básicamente, eso solo deja fuera las materias primas de los excipientes y la producción de moléculas pequeñas. Esperaría que esto cambiara, ya que se basa en algunas suposiciones con las que no estoy de acuerdo, pero no espero que ese cambio se produzca pronto. Hay que tener en cuenta que incluso los elementos «incluidos en el ámbito de aplicación» deben pasar por las fases de identificación y evaluación de riesgos. Ambas fases eliminan componentes del flujo de trabajo, lo que da lugar a análisis de laboratorio.

P: ¿Qué ensayos deberíamos, podríamos o deberíamos solicitar a nuestros proveedores de materiales de envasado para la evaluación de riesgos relacionados con las nitrosaminas en comprimidos, jarabes, supositorios y preparados inyectables?

R: En estos momentos, se considera que el riesgo de nitrosaminas lixiviables procedentes de los envases está relacionado exclusivamente con el uso de nitrocelulosa en las etiquetas adheridas directamente al envase primario y, de nuevo, se cree que se limita a los blísteres y las bolsas de infusión. Algunos han sugerido incluir preguntas sobre posibles nitrosaminas en las solicitudes técnicas dirigidas a los proveedores de envases y etiquetado. Como parte de un enfoque basado en el riesgo, esto se justifica fácilmente.

P: ¿Cuáles son los riesgos asociados a la formación de nitrosaminas en el organismo? ¿Existe alguna recomendación al respecto?

R: Se trata de un tema interesante y complejo. Sin duda, existe una posibilidad real y reconocida de que se formen nitrosaminas en el tracto gastrointestinal. Se han realizado algunos estudios que han analizado este tema en profundidad. Que yo sepa, no se han realizado estudios exhaustivos utilizando tecnologías modernas de LC-MS. Si bien es cierto que el tracto gastrointestinal reúne todos los factores necesarios para la nitrosación —temperatura, pH y cantidades de nitrito—, también contiene aminas primarias, que reaccionan preferentemente con el nitrito. Hace unos años dirigí un estudio de prueba de concepto que demostró la formación de nitrosaminas a gran escala en múltiples medios de disolución biorrelevantes. Sin embargo, es imposible replicar por completo las complejidades in vivo. También hay que señalar que en muchos alimentos comunes están presentes numerosas aminas vulnerables.

En definitiva, se necesita mucha más información para comprender plenamente el riesgo que corre el paciente. Las aportaciones procedentes de la formación gástrica, incluidos los alimentos, son relevantes.

P: Algunos artículos publicados recientemente han demostrado el impacto de los NOx en la formación de nitrosaminas en muestras pequeñas, a escala analítica. ¿Influye esto en la interpretación de los datos relativos a material a granel a gran escala?

R: Rok Gharek y su equipo han publicado un par de excelentes artículos sobre este tema, y tuve la oportunidad de hablar de ello directamente con él y con uno de sus coautores.^⁵ Parte del estudio analizó cómo el NOx saturaba distintos niveles de un tubo lleno de un principio activo (API) o un excipiente, para demostrar que no se trataba únicamente de una exposición superficial. Su conclusión fue que, si bien el NOx puede penetrar profundamente en las distintas capas de un envase a granel, el NOx disponible era consumido por las capas más externas del mismo.

Sinceramente, la única solución es realizar un buen remuestreo del material a granel, utilizando un muestreador para extraer muestras del núcleo. Habría que plantearse realizar algunos análisis en el laboratorio para determinar qué materiales están realmente en riesgo, ya que los artículos citados han demostrado que algunos materiales corren un riesgo mucho mayor que otros.

Ve el seminario web completo para obtener más detalles sobre los cambios que se están produciendo en el ámbito analítico de los ensayos de nitrosaminas.

Queremos expresar nuestro especial agradecimiento a Jason Brown, de Brown Pharma Consulting, por su intervención en el seminario web y por su ayuda a la hora de responder a estas preguntas.

Referencias

1. The Use of a Delay Column to Mitigate Persistent Interference Peaks in the Trace Level Quantitation of NDBA in Normal Saline Intravenous Infusion Bags Using UHPLC-MS/MS
2. Identification and Quantitation of N-Nitrosamines in Normal Saline Intravenous Infusion bags Using UHPLC-MS/MS
3. Aplicación del ajuste «inferior a la vida media» a las impurezas de nitrosaminas
4. Sistemas de cierre de envases para medicamentos de uso humano y productos biológicos
5. Grahek, R., et al. (2026). «Los niveles de nitrito en los excipientes no son atributos estáticos de los materiales: generación de nitrito a partir del NOx ambiental y consecuencias para la fabricación de medicamentos». Journal of Pharmaceutical Sciences 115(11).

Las opiniones aquí expresadas pertenecen exclusivamente a los autores principales y colaboradores, y no representan los puntos de vista de Waters Corporation. Se recomienda que realices tu propia evaluación de riesgos a la hora de tomar cualquier decisión basada en las directrices normativas.