亚硝胺检测的下一个前沿：包装及静脉输液袋中的检测与风险评估

亚硝胺分析不断推动分析实验室将灵敏度提升至新高度，而不断变化的监管环境则使讨论范围超越了传统检测的范畴。随着关注点转向其他N-亚硝基化合物（即o-NNOs）以及来自包装材料（如输液袋）的潜在可提取物和可浸出物（E&L），实验室在检测、定量和方法开发方面面临着新的挑战。

在最近的一次网络研讨会上，布朗制药咨询公司（Brown Pharma Consulting）的亚硝胺专家杰森·布朗（Jason Brown）与沃特世（Waters）的咨询科学家玛丽安·图希格（Marian Twohig）博士共同探讨了这一不断变化的行业格局。从新兴的亚硝胺考量及其与E&L的交集，到实现小分子二烷基亚硝胺严苛检测限的实用LC-MS/MS策略，他们回顾了行业的发展历程，分析了实验室当前面临的挑战，并展望了未来可能的发展趋势。

本博文将延续这一讨论，回答参会者在网络研讨会期间提出的一些问题。

问：能否详细说明一下延迟柱的使用及其对保留时间、压力以及与分析柱兼容性的影响？

A: The retention properties of the delay column 应等于或大于分析柱的保留时间，以确保干扰组分具有足够的延迟，从而防止其与待测物共洗脱。在流路中加入延迟柱后观察到的总体保留时间差，将与填充柱的体积、连接管路的体积以及泵的流速成正比。¹ 观测到的压差还将取决于添加的组分。 在网络研讨会中描述的实验细节中，延迟柱的颗粒尺寸为5 µm，尺寸为2.1 × 50 mm，实验流速为300 µL/min，使方法压力低于6000 psi。所施加的压力远低于分析用超高效液相色谱（UHPLC）泵的最大压力（15,000 psi）。

问：在从静脉输液袋中提取亚硝胺时，如何确定用于萃取的样品体积？

答：在本研究中，我们针对静脉输液袋中的溶液在其预期使用条件下进行了分析，从而实现了对小分子亚硝胺的低ng/mL级检测。^²如果静脉输液袋中溶液的给药量较大，可能需要进行浓缩步骤，以达到满足监管限值要求的灵敏度。 在这种情况下，可采用固相萃取（SPE）或液-液萃取来浓缩目标亚硝胺，从而确保用于分析的检测器能够达到所需的灵敏度水平。

小分子亚硝胺的极性各不相同。因此，所采用的固相萃取（SPE）化学方法应能够保留检测方法中的所有亚硝胺，并确保其具有良好的回收率。

问：对于提高分析方法中极性硝胺的保留性，您有什么建议吗？

答：为了利用反相液相色谱（RPLC）对极性化合物进行稳健的方法开发，目标分析物应具有不小于1.0的保留因子（k′），以确保其与色谱柱空隙体积之间有足够的分离。理想情况下，k′值应达到2.0或更高，以提高保留效果和方法的稳健性。

保留因子（也称为容量因子，k′）是衡量分析物在色谱柱上保留程度的指标。它反映了分析物与固定相相互作用的时间相对于流动相的时间比例。k′值越高，表明与固定相的相互作用越强，从而导致保留时间延长。 由于 k′ 描述了分析物相对于空隙体积的洗脱位置，因此它是评估基质组分或其他化合物可能造成干扰的有用参数——这些组分或化合物在接近空隙体积处洗脱，并可能影响分析物的检测。

可以采用多种方法来提高分析物的保留。选择具有增强极性保留特性的固定相通常是有益的。例如，专门为极性分析物设计的色谱柱，如 Waters XSelect HSS T3, Atlantis Premier BEH_C18AX，以及 CORTECS T3 色谱柱. 这些相能够提高极性化合物的保留效率，即使在高水含量流动相条件下也是如此。

方法开发应从降低流动相中有机溶剂的比例开始。在色谱柱化学性质允许的情况下，采用100%水相条件进行操作可进一步促进极性分析物的保留。充分的色谱柱再平衡也至关重要，建议在两次进样之间，在初始流动相条件下进行至少10个色谱柱体积的再平衡。

实现足够的保留可提高色谱法的鲁棒性，确保分析物与空体积充分分离，从而降低早期洗脱的干扰物对分析物灵敏度、准确度和再现性的潜在影响。如果采用反相液相色谱（RPLC）无法为目标亚硝胺获得可接受的保留效果，则应考虑采用其他保留机制。例如，亲水相互作用液相色谱（HILIC）可针对高极性化合物提供更好的保留和选择性。

问：您是如何确定最终方法中应采用的合适离子比值的？在常规分析中，软件是否有助于监测这些比值？

A: waters_connect for Quantitation Software 可配置为测量和监测MRM离子比。预期MRM离子比可在处理方法中指定；或者，也可在样品列表中指定参考标准，并据此自动计算预期离子比。规则集在软件中进行配置，用于在结果参数（包括MRM离子比）超出某组分的指定可接受标准时发出警示。在规则集中，会指定测量离子比与预期离子比之间的容差范围。 如果某样品产生的峰值超出指定容差范围，系统将按组分逐一标记该样品为异常。在数据汇总表中，可查看“离子比检查”列，以及检测到的各组分的通过/失败状态。

问：您是否曾就延迟列的使用问题与监管机构进行过讨论？

答：我们尚未与监管机构讨论过延迟柱的使用问题。在方法开发策略中纳入了延迟柱的使用，目的是去除一个在相同保留时间洗脱且会从NDBA的每个MRM过渡中产生信号的干扰峰，否则该干扰峰会在最终检测中导致NDBA检测结果出现歧义。

问：该机构是否接受基于毒理学评估和终身暴露策略，对高产量亲本品种中NDBA提高规格限值的理由？

答：在录制本视频时，答案是否定的。不过，美国食品药品监督管理局（FDA）最近发布的一份指南改变了这一立场。因此，现在允许对“小于有效期”的限值进行调整。此类调整必须针对每种产品分别进行，并以治疗时长为依据。需要明确的是，该指南适用于所有已上市药物，而不仅仅是注射剂。³

问：如果我的实验室已经开展亚硝胺分析，我们还能进行E&L分析吗？具体哪些产品和工艺真正属于分析范围？

答：进行非靶向分析所需的具体技能与靶向亚硝胺分析所需的技能大不相同。此外，虽然部分设备存在重叠，但极少完全重合。这一点甚至延伸到质谱（MS）需求方面，其中具备完整的谱图分析能力是必不可少的。为 make a typical MS lab into an E&L-specific lab 如果没有充足的预算和对分析师的大量投入，这些困难就很难克服。

“适用范围”是一个很好的问题。美国食品药品监督管理局（FDA）最近发布的《容器封口系统指南》新草案扩大了这一范围。^⁴因此，所有药用原料和药品均在适用范围内。此外，大分子药物和生物制品的所有生产工艺步骤也在适用范围内。基本上，只有辅料原料和小分子药物生产被排除在外。 我希望这一范围能有所调整，因为它基于一些我无法认同的假设，但我预计短期内不会有变化。请注意，即使是“在范围之内”的项目，也必须经过风险识别和风险评估这两个步骤。这两个步骤都会将某些组件从工作流程中剔除，从而导致需要进行实验室分析。

问：针对片剂、糖浆、栓剂和注射剂的亚硝胺风险评估，我们应该/可以/必须要求包装材料供应商提供哪些检测项目？

答：目前认为，包装中可浸出亚硝胺的风险完全与直接贴附于初级包装上的标签中所使用的硝化纤维素有关，而且，该风险据信仅限于泡罩包装和输液袋。有人建议在向包装和标签供应商发出的技术要求中加入关于潜在亚硝胺的问题。作为基于风险的方法的一部分，这一做法很容易得到合理说明。

问：体内形成亚硝胺会带来哪些风险？对此是否有相关指导意见？

A：这是一个既有趣又复杂的话题。毫无疑问，胃肠道中确实存在已知且被认可的亚硝胺形成可能性。已有少数研究对此进行了深入探讨。 据我所知，目前尚未有采用现代液相色谱-质谱（LC-MS）技术进行的全面研究。虽然胃肠道确实具备亚硝化反应所需的所有条件：温度、pH值和亚硝酸盐含量，且其中还存在能优先与亚硝酸盐发生反应的一级胺。 几年前，我曾领导过一项概念验证研究，结果表明在多种与生物相关的溶出介质中会发生大规模的亚硝胺生成。然而，要完全再现体内环境的复杂性是不可能的。还应注意的是，许多常见食物中都含有易发生亚硝化的胺类物质。

简而言之，要全面了解患者的风险，还需要做更多工作。胃部结构（包括食物）的影响是值得关注的。

问：最近发表的论文表明，在小型分析级样品中，NOx会影响亚硝胺的形成。这会影响对大规模散装材料数据的解释吗？

答：Rok Gharek 及其团队就这一主题发表了几篇精彩的论文，我有幸与他及其一位合著者就此进行了直接讨论。⁵该研究的一部分探讨了 NOx 如何渗透到装有活性药物成分（API）或辅料的管子的各个层次，以证明这不仅仅是表面接触的问题。 他们的结论是：虽然 NOx 可以深入渗透到散装容器的各个层次，但可利用的 NOx 已被散装物料的最外层消耗殆尽。

说实话，对散装物料进行妥善的重新取样——使用取样器从岩心中取样——是唯一可行的办法。应考虑在实验室开展一些工作，以确定哪些材料确实存在风险，因为所引用的论文表明，某些材料的风险远高于其他材料。

观看完整网络研讨会 ，以了解有关亚硝胺检测分析领域变化的更多详情。

特别感谢布朗制药咨询公司（Brown Pharma Consulting）的杰森·布朗（Jason Brown）在网络研讨会上所做的演讲，以及他在解答这些问题时提供的帮助。

参考文献

1. The Use of a Delay Column to Mitigate Persistent Interference Peaks in the Trace Level Quantitation of NDBA in Normal Saline Intravenous Infusion Bags Using UHPLC-MS/MS
2. Identification and Quantitation of N-Nitrosamines in Normal Saline Intravenous Infusion bags Using UHPLC-MS/MS
3. 将“小于寿命”调整法应用于亚硝胺杂质
4. 用于人类药品和生物制品的容器封口系统
5. Grahek, R. 等（2026）。《辅料中的亚硝酸盐含量并非静态的物料属性：环境中的氮氧化物（NOx）产生的亚硝酸盐及其对药品生产的影响》。《药学杂志》第115卷第11期。

本文所表达的观点仅代表第一作者和合著者本人，并不代表沃特斯公司（Waters Corporation）的观点。在根据监管指南做出任何决策时，请自行进行尽职调查。