Les PROTAC sont différents : qu'est-ce que cela implique pour la chromatographie en phase liquide ?

À mesure que la recherche pharmaceutique dépasse le cadre des inhibiteurs traditionnels à base de petites molécules, les scientifiques spécialisés en analyse sont amenés à caractériser des molécules de plus en plus complexes. Les chimères ciblant la protéolyse (PROTAC) en sont un exemple.

Les PROTAC associent deux éléments de liaison à un lieur afin de cibler de manière sélective des protéines en vue de leur dégradation. Leur taille plus importante, leur flexibilité et leurs multiples groupes fonctionnels peuvent soulever de nouvelles considérations analytiques par rapport aux petites molécules plus classiques.

Lorsqu'on élabore des méthodes, la question n'est pas de savoir si la chromatographie liquide fonctionne toujours. Elle fonctionne. La question qu'il faut se poser est de savoir comment aborder l'élaboration d'une méthode lorsque la molécule elle-même est plus complexe.

La complexité modifie les enjeux liés au développement des méthodes

Un PROTAC peut présenter un comportement différent de celui d'une petite molécule classique, d'une manière qui n'est pas toujours prévisible sur la seule base de son poids moléculaire. Il devient donc d'autant plus essentiel de surveiller la rétention, la sélectivité, la forme des pics, le taux de récupération et la reproductibilité.

Cela revêt une importance particulière alors que l'industrie pharmaceutique explore de nouvelles modalités thérapeutiques et s'efforce de mettre en place des processus analytiques fiables pour le développement, les essais de stabilité et le contrôle qualité.

Pour les scientifiques spécialisés dans l'analyse, cela peut signifier aller au-delà des modifications progressives apportées à un seul paramètre chromatographique.

Une approche systématique peut aider à identifier ce qui fonctionne, plutôt que de se fier à ce que l'on pense qui pourrait fonctionner.

Étude de cas sur l'élaboration d'une méthode systématique

Notre article récemment publié application note L'exemple du PROTAC ARV-825 illustre la méthode mise au point en un peu plus de deux jours.

L'ARV-825 est une molécule hétérobifonctionnelle composée de pomalidomide et de birabresib, reliés par un lien de polyéthylène glycol. Afin d'évaluer sa stabilité, le composé a été soumis à des conditions de dégradation forcée, ce qui a entraîné la formation de composants supplémentaires qu'il a fallu séparer et caractériser.

Plutôt que d'optimiser un paramètre chromatographique par essais et erreurs, l'étude a adopté une approche systématique.

Le processus a débuté par l'évaluation de la rétention dans différentes conditions de pH. Les conditions de pH faible ont permis une meilleure rétention des produits de dégradation de faible concentration, tandis que le pic principal de l'ARV-825 n'a été que peu affecté. Ces informations ont déterminé les conditions de la phase mobile pour l'étape suivante du criblage, à savoir l'ajout d'additifs à la phase mobile dans des conditions de pH faible.

L'étape suivante a consisté à introduire délibérément une sélectivité chromatographique en testant différentes combinaisons de phases fixes et de phases mobiles.

Cette distinction est importante. La modification du gradient influe sur la façon dont les composés se déplacent dans la colonne. Quant au changement de phase stationnaire, il peut modifier la manière dont ces composés interagissent avec la colonne dès le départ.

Pour les molécules complexes et les produits de dégradation inconnus, cette différence peut s'avérer déterminante.

Ne vous arrêtez pas au chromatogramme

Les travaux sur l'ARV-825 mettent également en évidence pourquoi LC-MS peut s'avérer utile lors de la mise au point d'une méthode.

Lorsque les produits de dégradation ne sont pas disponibles sous forme d'étalons individuels, la détection UV seule peut ne pas fournir suffisamment d'informations pour suivre avec certitude ce qui est séparé. Dans cette étude, la détection de masse a été utilisée pour aider à identifier et à suivre les composants en fonction de leur masse, fournissant ainsi des informations supplémentaires au cours du processus de séparation.

L'étude a également permis de comparer ces colonnes à des colonnes standard en acier inoxydable utilisant la même phase stationnaire. Des différences de rétention et de sélectivité ont été observées pour certains produits de dégradation, ce qui démontre que les interactions avec les surfaces métalliques peuvent constituer une variable supplémentaire dans l'équation chromatographique. Les colonnes MaxPeak Premier ont également fait preuve d'une meilleure reproductibilité de la surface des pics dans le cadre de cette étude.

Pour les molécules complexes, le fait de maîtriser les variables dès les premières étapes de la mise au point d'une méthode peut contribuer à réduire le risque de devoir revoir cette méthode par la suite.

Une approche plus réfléchie pour aboutir à des méthodes fiables

L'exemple de l'ARV-825 illustre un principe plus général applicable aux chercheurs en analyse qui travaillent sur de nouvelles classes de médicaments.

Lorsque la molécule est différente, la stratégie de mise au point de la méthode peut devoir être adaptée en conséquence.

Un protocole systématique permet de définir un cheminement logique, depuis la rétention et le criblage du pH jusqu'à la sélectivité en phase stationnaire, puis à l'optimisation et à la détection, tout en établissant une base plus traçable pour la méthode finale.

Dans l'étude ARV-825, l'association d'un dépistage systématique et MaxPeak Premier Columns a permis d'obtenir une résolution de référence des produits de dégradation détectés et du pic principal de l'ARV-825, la méthode ayant été mise au point en un peu plus de deux jours.

À mesure que la recherche pharmaceutique s'étend à des architectures moléculaires de plus en plus complexes, les processus analytiques devront évoluer en parallèle. L'objectif n'est pas de compliquer la chromatographie, mais de rendre le développement des méthodes plus réfléchi, plus reproductible et plus efficace.

Pour les scientifiques qui étudient les PROTAC et d’autres modalités émergentes à base de petites molécules, une combinaison judicieuse de criblage systématique, de sélectivité chromatographique, de contrôle de surface et de méthodes de détection complémentaires peut contribuer à transformer la complexité moléculaire en un défi analytique gérable.

En fin de compte, l'amélioration des méthodes d'analyse permet de fournir les informations fiables nécessaires au développement de nouveaux traitements et, par conséquent, d'accélérer la mise à profit des avancées scientifiques pour améliorer la santé humaine.

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