Kits SPE OligoWorks : Améliorer l'efficacité de la bioanalyse des oligonucléotides

Au cours des dix dernières années, la création de médicaments synthétiques à base d'oligonucléotides a connu un regain d'intérêt, ce qui a donné lieu à de nombreux nouveaux projets et développements dans l'industrie. Cette résurgence a conduit à des pipelines en plein essor. Ces thérapies à base d'acides nucléiques courts agissent au niveau de la transcription et de la traduction des gènes et sont très prometteuses pour traiter non seulement des maladies héréditaires rares, mais aussi des affections historiquement difficiles à traiter, telles que les maladies cardiovasculaires. En octobre 2023, Waters a introduit OligoWorks SPE Kits and Components pour la bioanalyse des oligonucléotides. Auparavant, un seul kit d'extraction SPE pour la bioanalyse des oligonucléotides était disponible dans le commerce. Le lancement de notre gamme de produits SPE OligoWorks a permis aux scientifiques bioanalytiques de disposer de plus d'une option SPE pour l'extraction des oligonucléotides.

Approbation du marché des médicaments et études précliniques

Un rapport du premier trimestre 2024 de l'American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT) en collaboration avec CiteLine indique qu'il y a maintenant plus de 300 interférences ARN et plus de 250 oligonucléotides antisens dans le pipeline, ce qui représente une augmentation de 20 % du pipeline au cours de l'année écoulée, 30 % des candidats étant maintenant en phase d'essai clinique.

Comme pour tout médicament, l'autorisation de mise sur le marché nécessite des analyses quantitatives minutieuses qui révèlent dans quelle mesure ces médicaments sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans les systèmes biologiques, en commençant par des études précliniques sur des modèles animaux et en passant ensuite à des essais cliniques sur des patients humains, sous réserve de l'obtention de l'autorisation réglementaire. Les flux de travail de la chromatographie en phase liquide et de la spectrométrie de masse (LC-MS) sont les plus utilisés pour effectuer ces mesures quantitatives, mais la précision et la sensibilité des mesures dépendent largement de la capacité à extraire de manière cohérente les oligonucléotides et/ou leurs métabolites des biofluides (plasma, urine, etc.) ou des échantillons de tissus. À cette fin, l'extraction liquide-liquide (LLE) et l'extraction en phase solide (SPE) sont les deux principales techniques d'extraction utilisées aujourd'hui, et bien qu'elles soient toutes deux efficaces, la LLE est plus difficile à mettre à l'échelle et à automatiser. C'est pourquoi les organismes de recherche sous contrat et les laboratoires pharmaceutiques de bioanalyse (BioA) préfèrent généralement l'approche SPE.

Quelles sont les différences entre les deux kits disponibles sur le marché ?

Alors que nous approchons du premier anniversaire du lancement des trousses SPE OligoWorks et que nous continuons à acquérir de l'expérience grâce à nos travaux de développement d'applications et à nos collaborations, nous avons appris que la performance quantitative est en grande partie fonction du dispositif SPE/du sorbant et du protocole qui fonctionnent ensemble. Bien que les deux kits utilisent un sorbant polymère à mode mixte pour capturer sélectivement les oligonucléotides thérapeutiques et leurs métabolites, les formulations et les processus de fabrication des sorbants sont différents, ce qui confère à chacun d'eux des caractéristiques de liaison ionique et hydrophobe uniques pour la sélectivité. Par conséquent, les méthodes utilisées pour chacune d'entre elles ne sont pas interchangeables. L'utilisation du protocole SPE d'OligoWorks avec une microplaque d'un concurrent au lieu d'une microplaque d'OligoWorks donnera des résultats très différents.

• Les deux protocoles de kit commencent par une étape de prétraitement de l'échantillon afin de rompre la liaison étroite entre les protéines et les oligonucléotides dans les échantillons biologiques, ce qui permet une plus grande récupération des oligonucléotides. Les méthodes permettant d'obtenir cette rupture sont toutefois très différentes entre les deux solutions basées sur les kits SPE.
• Le protocole de notre concurrent utilise un tampon de lyse contenant du détergent Triton-X pour dénaturer les protéines et inhiber l'activité des nucléases et des protéases, ainsi que du TCEP pour réduire les liaisons disulfures et de la cystéine pour empêcher la désulfuration des oligonucléotides phosphorothioés.
• Le protocole de prétraitement des échantillons SPE d'OligoWorks, en revanche, utilise une approche sans détergent qui vise à digérer toutes les protéines de chaque échantillon à l'aide d'une enzyme protéolytique hautement active - Waters Rapizyme™ Proteinase-K - ainsi que du TCEP pour réduire les liaisons disulfures et de la Guanidine HCL - un dénaturant de protéines - qui servent tous deux à améliorer l'efficacité de la digestion.
• Bien que les deux méthodes fonctionnent bien, le détergent utilisé dans le protocole des concurrents nécessite souvent des étapes de lavage supplémentaires, peut être plus difficile à automatiser en raison de la formation de mousse, et l'éluat SPE final contenant les oligonucléotides extraits n'est pas compatible avec la MS et doit donc être évaporé et reconstitué avant l'analyse LC-MS.
• Le protocole OligoWorks SPE sans détergent, en revanche, nécessite moins d'étapes de lavage, peut être facilement automatisé et l'éluat final est compatible avec la spectroscopie de masse, de sorte que les échantillons peuvent être directement injectés dans un système LC-MS sans nécessiter d'évaporation et de reconstitution.

Conclusion

Le domaine des oligonucléotides thérapeutiques continue d'évoluer, entraînant le développement de technologies de préparation d'échantillons plus sophistiquées pour extraire les oligonucléotides des échantillons biologiques. L'extraction en phase solide reste la méthode préférée aujourd'hui en raison de sa capacité à être mise à l'échelle et automatisée. OligoWorks SPE Kits de Waters offrent aux scientifiques bioanalytiques un flux de travail automatisé, sans détergent, qui produit un éluat concentré prêt pour l'analyse LC-MS directe, sans évaporation ni reconstitution.

Ressources supplémentaires :

OligoWorks SPE Landing Page

Application Note: Standardized, Kit-Based Approach for Selective and Reproducible Sample Preparation and Extraction for Therapeutic Oligonucleotides from Biological Matrices

Application Note: Automated, Kit-Based Sample Preparation Workflow for Bioanalytical Quantification of Therapeutic Oligonucleotides