Kits de SPE OligoWorks: Aumento de la eficacia del bioanálisis de oligonucleótidos

En los últimos 10 años se ha renovado el interés por la creación de fármacos oligonucleotídicos sintéticos, lo que ha dado lugar a numerosos proyectos y desarrollos nuevos en la industria. Este resurgimiento ha dado lugar a una floreciente cartera de proyectos. Estos fármacos cortos basados en ácidos nucleicos actúan a nivel de la transcripción y traducción de genes y son muy prometedores para tratar no sólo trastornos hereditarios raros, sino también dolencias históricamente difíciles de tratar, como las enfermedades cardiovasculares. En octubre de 2023, Waters presentó OligoWorks SPE Kits and Components para el bioanálisis de oligonucleótidos. Anteriormente, sólo se comercializaba un kit de extracción SPE para el bioanálisis de oligonucleótidos. El lanzamiento de nuestra línea de productos OligoWorks SPE ha permitido a los científicos bioanalíticos disponer de más de una opción SPE para la extracción de oligonucleótidos.

Aprobación de medicamentos y estudios preclínicos

Un informe del primer trimestre de 2024 de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular (ASGCT), en colaboración con CiteLine, indica que en la actualidad hay más de 300 terapias de ARN de interferencia y más de 250 terapias con oligonucleótidos antisentido, lo que representa un aumento del 20% en la cartera de productos en fase de desarrollo en el último año, con un 30% de candidatos en fase de pruebas clínicas.

Como ocurre con cualquier fármaco, la autorización de comercialización requiere análisis cuantitativos minuciosos que revelen el grado de absorción, distribución, metabolización y excreción de estos fármacos en los sistemas biológicos, comenzando con estudios preclínicos en modelos animales y pasando finalmente a ensayos clínicos con pacientes humanos, siempre que se obtenga la autorización reglamentaria. Los flujos de trabajo de espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS) son los más utilizados para realizar estas mediciones cuantitativas, pero la precisión y sensibilidad de las mediciones depende en gran medida de la capacidad de extraer de forma consistente oligonucleótidos y/o sus metabolitos a partir de biofluidos (plasma, orina, etc.) o muestras de tejido. Con este fin, la extracción líquido-líquido (LLE) y la extracción en fase sólida (SPE) son las dos técnicas de extracción dominantes utilizadas hoy en día, y aunque ambas funcionan bien, la LLE es más difícil de escalar y automatizar. Por ello, las organizaciones de investigación por contrato y los laboratorios farmacéuticos bioanalíticos (BioA) suelen preferir el método SPE.

¿Cuáles son las diferencias entre los dos kits del mercado?

A medida que nos acercamos a la marca de un año del lanzamiento de los kits SPE OligoWorks y seguimos adquiriendo experiencia a través de nuestro trabajo de desarrollo de aplicaciones y colaboraciones en curso, hemos aprendido que el rendimiento cuantitativo es en gran medida una función del dispositivo/absorbente SPE y el protocolo que trabajan juntos. Aunque ambos kits utilizan un sorbente polimérico de modo mixto para capturar selectivamente oligonucleótidos terapéuticos y sus metabolitos, las formulaciones y los procesos de fabricación del sorbente son diferentes, lo que confiere a cada uno sus propias características iónicas e hidrófobas de unión para la selectividad. En consecuencia, los métodos para cada uno de ellos no son intercambiables. El uso del protocolo OligoWorks SPE con una microplaca de la competencia en lugar de una microplaca OligoWorks producirá resultados muy diferentes.

• Los protocolos de ambos kits comienzan con un paso de pretratamiento de la muestra para romper la estrecha unión entre proteínas y oligonucleótidos en las muestras biológicas, permitiendo así una mayor recuperación de oligonucleótidos. Sin embargo, los métodos para lograr esta disrupción son muy diferentes entre las dos soluciones basadas en kits SPE.
• El protocolo de nuestro competidor utiliza un tampón de lisis que contiene detergente Triton-X para desnaturalizar las proteínas e inhibir la actividad de las nucleasas y proteasas, junto con TCEP para reducir los enlaces disulfuro y Cisteína para evitar la desulfurización de los oligonucleótidos fosforotiados.
• Por el contrario, el protocolo de pretratamiento de muestras OligoWorks SPE utiliza un enfoque sin detergentes que tiene como objetivo digerir todas las proteínas de cada muestra utilizando una enzima proteolítica altamente activa - Waters Rapizyme™ Proteinase-K junto con TCEP para reducir los enlaces disulfuro y Guanidine HCL - un desnaturalizante de proteínas que sirven para mejorar la eficiencia de la digestión.
• Aunque ambos métodos funcionan bien, el detergente del protocolo de la competencia suele requerir pasos de lavado adicionales, puede ser más difícil de automatizar debido a la formación de espuma, y el eluido SPE final que contiene los oligonucleótidos extraídos no es compatible con la EM y, por tanto, debe evaporarse y reconstituirse antes del análisis LC-MS.
• En cambio, el protocolo OligoWorks SPE sin detergente requiere menos pasos de lavado, puede automatizarse fácilmente y el eluido final es compatible con la EM, por lo que las muestras pueden inyectarse directamente en un sistema LC-MS sin necesidad de evaporación y reconstitución.

Conclusión

El campo de la terapéutica oligonucleotídica sigue evolucionando, impulsando el desarrollo de tecnologías de preparación de muestras más sofisticadas para extraer oligonucleótidos de muestras biológicas. Actualmente, la extracción en fase sólida sigue siendo el método preferido por su capacidad de ampliación y automatización. OligoWorks SPE Kits de Waters ofrecen a los científicos bioanalíticos un flujo de trabajo automatizado y sin detergentes que produce un eluido concentrado listo para el análisis LC-MS directo sin evaporación ni reconstitución.

Recursos adicionales:

OligoWorks SPE Landing Page

Application Note: Standardized, Kit-Based Approach for Selective and Reproducible Sample Preparation and Extraction for Therapeutic Oligonucleotides from Biological Matrices

Application Note: Automated, Kit-Based Sample Preparation Workflow for Bioanalytical Quantification of Therapeutic Oligonucleotides