Exploration des techniques d'imagerie cellulaire – Types, analyse et applications

Il est important de comprendre les fonctions cellulaires telles que la migration, la morphologie et les changements physiologiques dans les cellules saines et malades afin de saisir les processus biologiques et de les utiliser pour optimiser la création de thérapies biologiques. L'imagerie de cellules vivantes fournit une image instantanée de l'état actuel d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme, aussi proche que possible de l'état in vivo, sans introduire les artefacts observés avec les cellules fixées.  

L'imagerie cellulaire est un moyen non invasif de suivre les attributs liés à la santé et les anomalies liées à la maladie dans le cancer et d'autres troubles. L'imagerie cellulaire fournit des informations importantes sur l'étiologie, la progression et l'issue finale des maladies. L'imagerie permet de quantifier automatiquement les propriétés des cellules et de dresser le profil des changements phénotypiques qui peuvent survenir au cours de la maladie, de la croissance et de la modification génétique des cellules. L'imagerie en direct est essentielle pour comprendre les fonctions et les processus cellulaires, car elle permet une reconstruction précise, et souvent en temps réel, des événements cellulaires. Il s'agit d'une observation avancée des cellules fixées qui ne fournit qu'un seul point dans le temps et non l'ensemble du processus par lequel passe une cellule. Cependant, il est également nécessaire que les techniques d'imagerie cellulaire en direct offrent une pénétration à 100 %. Manquer une étape ou un processus peut signifier passer à côté d'un événement clé dans les cellules saines ou malades. 

Types de techniques d'imagerie cellulaire 

Microscopie optique 

• Microscopie en champ clair —Technique la plus traditionnelle (et la plus ancienne) de microscopie, elle reste précieuse pour réaliser des tests cellulaires sans marquage afin d'étudier le nombre, la prolifération, la santé, la confluence et la cytotoxicité des cellules.  Basée sur les changements d'absorption de la lumière, d'indice de réfraction ou de couleur pour générer un contraste, cette technique reste l'une des techniques de microscopie optique les plus appréciées. Lorsque la lumière traverse une cellule (ou un tissu ou un organisme), les régions qui modifient la direction, la vitesse ou le spectre des ondes lumineuses génèrent des contrastes lorsque les rayons lumineux sont rassemblés et focalisés. 
• Microscopie à contraste de phase —Cette technique traduit les variations infimes de phase en changements correspondants de l'amplitude lumineuse, qui sont ensuite visualisés sous forme de différences de contraste dans l'image. Un condenseur spécialisé avec des anneaux correspond à un ensemble d'objectifs contenant des anneaux dans le plan focal arrière. Cette technique permet d'augmenter le contraste lors de l'imagerie de cellules vivantes en culture. Cependant, elle peut également produire des halos excessifs sur les contours des bords, réduisant ainsi la visibilité des détails des limites.  
• Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) —Avec cette technique, la lumière polarisée plane et les prismes de cisaillement de la lumière amplifient les différences infimes entre les épaisseurs des échantillons et leurs indices de réfraction. Cela permet d'obtenir de meilleures images des bicouches lipidiques cellulaires grâce aux différences de réfraction entre les parties aqueuses et lipidiques de la cellule.  

Microscopie à fluorescence 

• Microscopie à fluorescence de base —Cette technique utilise également un microscope optique, mais qui utilise la fluorescence plutôt que la lumière diffusée ou réfléchie pour observer la structure et les fonctions cellulaires. Avec cette technique, une lumière de longueur d'onde plus courte excite un fluorophore, qui émet ensuite une lumière de longueur d'onde plus longue. Cette lumière est détectée par le microscope.  
• FMM/IMC/SIMI —  La colonne vertébrale du Aura system of analyzers, Cette technologie combine les effets de la microscopie optique et de la microscopie à fluorescence existantes.  L'imagerie par membrane en arrière-plan (BMI) est une technique d'imagerie à contraste élevé qui utilise une membrane à contraste élevé pour développer des images claires des particules présentes dans un échantillon. Elle ne nécessite que 5 µl d'échantillon et peut fournir des résultats en une minute. La microscopie à membrane par fluorescence (FMM) marque les particules à l'aide de colorants fluorescents ou d'anticorps spécifiques, ce qui permet une identification simple et définitive. La SIMI, ou imagerie membranaire à éclairage latéral, fonctionne avec la BMI et la FMM en détectant la diffusion de la lumière, en particulier les particules à indice de réfraction élevé, y compris celles qui dépassent de la surface de la membrane. Les particules qui diffusent la lumière avec la SIMI indiquent la présence de matières inorganiques dépassant de la membrane, telles que le verre ou le plastique. Les particules qui absorbent la lumière indiquent la présence de particules métalliques, telles que les résidus de Dynabeads.^TM, et absorbant les huiles qui dépassent également de la membrane. 

• Microscopie confocale —Type de microscopie à fluorescence qui utilise certains composants optiques pour générer des images haute résolution de matériaux colorés à l'aide de sondes fluorescentes. Cette méthode permet d'obtenir des images tridimensionnelles nettes. Elle utilise un trou d'épingle spatial pour bloquer la lumière floue lors de la formation de l'image. 
• Microscopie à deux photons —Également appelée 2PEF ou TPEF, ce type de microscopie diffère légèrement de la microscopie à fluorescence standard, car elle repose sur l'excitation simultanée par deux photons dont les longueurs d'onde sont supérieures à celles de la lumière émise. Le laser se concentre sur un emplacement spécifique du tissu et balaye l'échantillon afin de produire l'image de manière séquentielle. Cette technique est utile pour les tissus d'une épaisseur maximale de 1 mm. 

Techniques avancées

• Super-résolution (STED, PALM, STORM) —Cette technique génère des images d'une résolution bien supérieure à celle de la microscopie optique, qui est limitée à environ 200 nm. L'épuisement par émission stimulée (STED), la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie de localisation par photoactivation (PALM) peuvent fournir des résolutions environ 20 fois supérieures à celles des microscopes optiques.  
• Fluorescence à réflexion interne totale (TIRM)– Cette méthode suit et détecte les objets à l'aide de la lumière diffusée par un champ d'ondes oscillantes près d'une interface diélectrique. Elle offre un rapport signal/bruit élevé et une résolution spatiale verticale élevée. 
• Microscopie électronique —Ces microscopes focalisent des faisceaux d'électrons plutôt que des photons pour produire une image d'un échantillon. Ils sont considérés comme offrant une meilleure résolution et un grossissement supérieur à celui des microscopes optiques.  
• Microscopie électronique à transmission (MET) —Utilisée pour obtenir des images des plus petites structures de la matière, la MET utilise un faisceau d'électrons qui traverse un échantillon, révélant ainsi l'organisation interne et la composition d'un tissu, d'une cellule ou d'un autre matériau.  
• Microscopie électronique à balayage (MEB) — À l'instar des autres méthodes de microscopie électronique, la MEB utilise des faisceaux d'électrons, mais elle examine la surface et la composition d'un échantillon plutôt que son intérieur.  

Autres techniques d'imagerie

• Microscopie à force atomique (AFM) —Cette technique permet de développer des images à l'échelle nanométrique des surfaces de matériaux biologiques dans leur environnement naturel. Grâce à cette technique, une sonde mécanique utilise des forces électriques pour générer des mouvements minuscules mais précis et exacts sur commande (électronique) afin d'obtenir un balayage précis. 
• Criblage à haut contenu —Il s'agit d'un ensemble de tests, souvent réalisés à l'aide de colorants fluorescents, qui permettent de visualiser les cellules et de déterminer leurs fonctions et leur fonctionnement. La résolution des techniques de microscopie à haut contenu a dépassé celle de la microscopie traditionnelle. Ces techniques intègrent l'imagerie et l'analyse automatisées pour les études à grande échelle des cellules.

Analyse des données d'imagerie cellulaire

Traitement d'image -Il existe plusieurs techniques permettant d'améliorer la qualité et la clarté des images. De plus, des organismes scientifiques ont élaboré des listes de contrôle pour la publication d'images microscopiques claires et de haute qualité. Tout d'abord, ce qui peut sembler évident, assurez-vous que votre microscope est correctement aligné (condenseur et lentille) et utilisez le réglage correct du diaphragme (pour la microscopie optique). Des directives sont également disponibles pour d'autres méthodes, telles que la microscopie à fluorescence. 

Christian Tischer, chef d'équipe au Centre des sciences des données de l'Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL), a souligné que « pour la recherche basée sur la microscopie, cela va de questions telles que la lisibilité des données d'images dans les figures publiées, la fourniture d'informations sur l'échelle et le choix responsable des réglages de contraste, au partage des données d'images dans des archives publiques et à la mise à disposition du pipeline d'analyse sur des plateformes de cloud computing ». 

The Aura system of particle analyzers combine les technologies de lumière (c'est-à-dire champ clair) et de fluorescence pour créer des tests plus sensibles avec des images à plus haute résolution. Le système comprend également Programmes analytiques Particle Vue qui contribuent à améliorer les images et fournissent des données quantitatives exploitables.  

Analyse quantitative -Les images ne sont pas très utiles si elles ne permettent pas d'extraire des données quantitatives. Plusieurs outils permettent de compter les cellules et les particules dans un échantillon, d'évaluer la cytotoxicité à l'aide de tests de viabilité, de mesurer l'autophagie, de déterminer les phénotypes cellulaires tels que la forme, la taille et la structure des cellules, de localiser des molécules spécifiques dans les cellules et d'analyser les processus dynamiques au fil du temps.  

Interprétation des données

Analyse morphologique — Déterminer la taille, la forme et la structure des cellules et autres particules et composants en culture peut aider à évaluer l'efficacité des traitements candidats, ainsi qu'à illustrer les changements qui surviennent en raison de la maladie. The Aura family of analyzers et Logiciel d'analyse Particle Vue peut déterminer avec précision la morphologie et les changements qui se produisent dans les cellules saines et malades, ainsi que dans les réactions aux traitements médicamenteux. Une méthode courante pour déterminer les cellules viables par rapport aux cellules non viables consiste à colorer les cellules avec du DAPI et à utiliser le FMM sur Aura pour déterminer la population des conditions cellulaires. 

Localisation moléculaire —Localiser précisément l'emplacement exact de molécules spécifiques dans les cellules peut aider à déterminer leur rôle dans la santé, les maladies et les réactions aux traitements. Ces techniques, telles que le suivi de particules individuelles (SPT) et la microscopie de localisation de molécules individuelles (SMLM), permettent d'identifier des molécules à l'échelle nanométrique et de déterminer la position et le mouvement des protéines et d'autres molécules importantes au sein d'une cellule.  

Imagerie en accéléré —La surveillance des réponses cellulaires sur une période donnée peut aider à déterminer le moment opportun pour lire les résultats finaux des tests, caractériser la cinétique cellulaire de plusieurs réactions à la fois et suivre en temps réel les effets des traitements sur les cellules. L'imagerie en accéléré automatisée peut également réduire considérablement les temps d'analyse.  

Techniques analytiques avancées

Reconstruction 3D —Ces techniques utilisent des données d'imagerie pour créer des modèles tridimensionnels de cellules et de composants cellulaires. La culture cellulaire 3D (ou construction automatisée) offre une physiologie plus pertinente que les techniques traditionnelles monocouches (2D).  

Imagerie par durée de vie de fluorescence (FLIM) —Cette technique avancée permet l'enregistrement simultané de la durée de vie de fluorescence et de la localisation spatiale des fluorophores dans une image. La FLIM peut aider les chercheurs à étudier le pH, les concentrations ioniques, la polarité des solvants, les interactions non covalentes, la viscosité et la tension d'oxygène dans les cellules vivantes.  

Applications des techniques d'imagerie cellulaire

Recherche en biologie cellulaire 

Étude de la structure et du fonctionnement des cellules —La structure des organites cellulaires et des membranes est essentielle pour comprendre comment les cellules se développent et comment se déroulent les processus génétiques, physiologiques et de développement. Cela peut être important pour comprendre le fonctionnement de base des cellules, mais aussi leur comportement en cas de maladie. L'imagerie peut également aider à déterminer la fonction de ces structures cellulaires. L'imagerie cellulaire en accéléré peut illustrer les changements que subissent (ou activent) ces structures au cours du développement, de la santé, de la maladie et de la mort.  

Suivi de la dynamique cellulaire —Les techniques d'imagerie aident les chercheurs à observer la migration, la division et la différenciation cellulaires, le tout en temps réel. Les processus cellulaires s'étendent sur plusieurs échelles de temps et de longueur, y compris les processus de développement et les métastases cancéreuses. Différentes techniques permettent de déterminer comment ces processus fonctionnent, soit en temps réel, en trois dimensions, soit dans les membranes cellulaires/subcellulaires.  

Recherche médicale 

Mécanismes pathologiques —Les techniques d'imagerie cellulaire permettent de mieux comprendre comment les maladies apparaissent dans une cellule, prennent le contrôle de ses fonctions (dans certains cas) et finissent par l'endommager ou la détruire. La microscopie 3D est à l'étude pour voir si elle permet d'observer les changements qui se produisent dans les cellules nerveuses lors de la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson, tandis que la microscopie à super-résolution est utilisée pour visualiser et quantifier les protéines membranaires des plaquettes lors des réponses immunitaires. D'autres techniques de fluorescence sont utilisées pour visualiser le fonctionnement des thérapies à base de cellules CAR-T et pour mieux comprendre la mort cellulaire contrôlée.  

Découverte et développement de médicaments —Obtenir des images précises et détaillées de la structure et du fonctionnement des cellules en réaction à des molécules candidates à des médicaments est un élément crucial de la découverte et du développement de nouveaux traitements et vaccins contre les maladies. Des techniques telles que le système Aura d'analyseurs de particules peuvent utiliser la FMM et la BMI, combinant des méthodes de microscopie optique et fluorescente pour déterminer comment les cellules réagissent aux molécules candidates à des médicaments et quels autres facteurs moléculaires et structurels peuvent interférer avec cette réponse.  

Recherche génétique 

Études sur l'expression génétique —Associée à des techniques génétiques sophistiquées telles que le séquençage de nouvelle génération, la microscopie permet d'identifier les changements phénotypiques qui surviennent lors de modifications du génotype. La microscopie électronique permet d'identifier des protéines spécifiques et d'autres changements moléculaires, tandis que les techniques de microscopie optique et à fluorescence permettent de produire des images montrant comment les structures et les fonctions cellulaires changent en réaction à des altérations génétiques. Les progrès réalisés dans l'imagerie de cellules vivantes permettent de visualiser en temps réel l'expression génétique et les interactions intracellulaires. 

CRISPR et génie génétique —CRISPR-Cas9 est un outil d'édition génétique puissant et polyvalent, mais il peut également être utilisé pour visualiser la réplication et les mutations de l'ADN dans des cellules vivantes. La protéine Cas9, marquée par une protéine fluorescente, peut marquer un locus ciblé et être visualisée à l'aide d'un microscope. D'autres scientifiques étudient comment CRISPR peut développer des images tridimensionnelles du génome et des portraits de chromosomes entiers. De même, l'imagerie moléculaire dans le rapport et l'évaluation de l'état des greffes cellulaires — ainsi que leur relation avec le microenvironnement local, les remplacements cellulaires et/ou les remplacements génétiques — fait de l'imagerie cellulaire un moyen prometteur pour déterminer les effets des techniques de génie génétique.  

Conclusion

Bien que l'imagerie ait fait des progrès spectaculaires au cours des dernières décennies, l'observation des cellules et des processus subcellulaires à haute résolution tout en conservant le contexte environnemental reste difficile, en particulier de manière peu invasive. La résolution cellulaire, en particulier dans le contexte et dans les organismes vivants, doit encore être améliorée (plusieurs projets expérimentaux sont en cours). L'observation des protéines dans les cellules – y compris leur structure, leur quantité, leur emplacement dans les cellules et leur activité – peut être réalisée à l'aide de la microscopie électronique, mais des techniques permettant de voir en temps réel et de visualiser des molécules plus petites sont nécessaires. La collecte et l'analyse des données nécessitent des normes plus universelles, et un meilleur accès mondial à ces technologies fera considérablement progresser la recherche scientifique.  

Références

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01987-9

https://www.nature.com/articles/s41592-021-01156-w?fromPaywallRec=false

https://www.nature.com/articles/d42473-022-00356-y

^DynabeadsTM est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.