Exploración de las técnicas de imagen celular: tipos, análisis y aplicaciones

Comprender funciones celulares como la migración, la morfología y los cambios fisiológicos en células sanas y enfermas es importante para entender los procesos biológicos y utilizarlos para optimizar la creación de terapias biológicas. Las imágenes de células vivas proporcionan una imagen instantánea del estado actual de una célula, tejido u organismo, lo más cercana posible al estado in vivo, sin introducir los artefactos que se observan en las células fijadas.  

La obtención de imágenes celulares es una forma no invasiva de realizar un seguimiento de los atributos relacionados con la salud y las anomalías relacionadas con enfermedades como el cáncer y otros trastornos. La obtención de imágenes celulares proporciona información importante sobre la etiología, la progresión y el destino final de las enfermedades. Las imágenes pueden cuantificar automáticamente las propiedades de las células y perfilar los cambios fenotípicos que pueden producirse durante la enfermedad, el crecimiento y la modificación genética de las células. La imagenología en vivo es crucial para comprender las funciones y los procesos celulares, ya que permite la reconstrucción precisa, y a menudo en tiempo real, de los eventos celulares. Se trata de una observación avanzada de células sobrefijadas que solo proporciona un único punto en el tiempo y no todo el proceso por el que pasa una célula. Sin embargo, también es necesario que las técnicas de imagenología de células vivas proporcionen una penetración del 100 %. Pasar por alto un paso o proceso puede significar ignorar un evento clave en células sanas o enfermas. 

Tipos de técnicas de imagen celular 

Microscopía óptica 

• Microscopía de campo claro:la forma más tradicional (y antigua) de microscopía, esta técnica sigue siendo valiosa para realizar ensayos celulares sin marcadores para observar el número de células, la proliferación, la salud, la confluencia y la citotoxicidad.  Basada en los cambios en la absorción de la luz, el índice de refracción o el color para generar contraste, esta técnica sigue siendo una de las técnicas de microscopía óptica favoritas. A medida que la luz atraviesa una célula (o tejido u organismo), las regiones que alteran la dirección, la velocidad o el espectro de la onda luminosa generan contrastes cuando los rayos de luz se recogen y se enfocan. 
• Microscopía de contraste de fase:esta técnica traduce pequeñas variaciones en la fase en cambios correspondientes en la amplitud de la luz, que luego se visualizan como diferencias de contraste en la imagen. Un condensador especializado con anillos coincide con un conjunto de objetivos que contienen anillos en el plano focal posterior. Esta técnica puede aumentar el contraste al obtener imágenes de células vivas en cultivo. Sin embargo, también puede producir halos excesivos en los contornos de los bordes, lo que reduce la visibilidad de los detalles de los límites.  
• Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC):con esta técnica, la luz polarizada plana y los prismas de corte de luz exageran las pequeñas diferencias en el grosor de las muestras y sus índices de refracción. Esto permite obtener mejores imágenes de las bicapas lipídicas celulares debido a las diferencias de refracción entre las partes acuosas y lipídicas de la célula.  

Microscopía de fluorescencia 

• Microscopía de fluorescencia básica:sigue utilizando un microscopio óptico, pero en lugar de luz dispersa o reflejada, utiliza fluorescencia para observar la estructura y las funciones celulares. Con esta técnica, una longitud de onda de luz más corta excita un fluoróforo, que a continuación emite luz con una longitud de onda más larga. El microscopio detecta esta luz.  
• FMM/IMC/SIMI —  La columna vertebral de la Aura system of analyzers, Esta tecnología combina los efectos de la microscopía óptica y la microscopía de fluorescencia existentes.  La imagen de membrana con fondo (BMI) es una técnica de imagen de alto contraste que implica el uso de una membrana de alto contraste que desarrolla imágenes nítidas de las partículas de una muestra. Solo requiere 5 µl de muestra y puede ofrecer resultados en un minuto. La microscopía de membrana fluorescente (FMM) etiqueta las partículas utilizando tintes fluorescentes o anticuerpos específicos, lo que da como resultado una identificación sencilla y definitiva. La SIMI, o imagen de membrana con iluminación lateral, funciona con la BMI y la FMM detectando la dispersión de la luz, concretamente las partículas con un índice de refracción elevado, incluidas las que sobresalen de la superficie de la membrana. Las partículas que dispersan la luz con la SIMI indican la presencia de materia inorgánica que sobresale de la membrana, como vidrio o plástico. Las partículas que absorben la luz son indicativas de partículas metálicas, como los residuos de Dynabeads.^TM, y absorbiendo los aceites que también sobresalen de la membrana. 

• Microscopía confocal:tipo de microscopía de fluorescencia que utiliza determinados componentes ópticos para generar imágenes de alta resolución de material teñido con sondas fluorescentes. Este método es capaz de generar imágenes nítidas y tridimensionales. Utiliza un orificio espacial para bloquear la luz desenfocada en la formación de la imagen. 
• Microscopía de dos fotones:también denominada 2PEF o TPEF, este tipo de microscopía es ligeramente diferente de la microscopía de fluorescencia estándar, ya que se basa en la excitación simultánea de dos fotones con longitudes de onda más largas que la luz emitida. El láser se enfoca en una ubicación específica del tejido y escanea la muestra para producir la imagen de forma secuencial. Esta técnica es útil para tejidos de hasta 1 mm de grosor. 

Técnicas avanzadas

• Superresolución (STED, PALM, STORM):esta técnica genera imágenes con una resolución mucho mayor que la microscopía óptica, que está limitada a unos 200 nm. La depleción por emisión estimulada (STED), la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización por fotoactivación (PALM) pueden proporcionar resoluciones unas 20 veces superiores a las de los microscopios ópticos.  
• Fluorescencia por reflexión interna total (TIRM): este método rastrea y detecta objetos utilizando la luz dispersada desde un campo de ondas oscilantes cerca de una interfaz dieléctrica. Tiene una alta relación señal-ruido y una alta resolución espacial vertical. 
• Microscopía electrónica:estos microscopios enfocan haces de electrones en lugar de fotones para producir una imagen de una muestra. Se consideran de mayor resolución y con mayor aumento que los microscopios basados en luz.  
• Microscopía electrónica de transmisión (TEM): utilizada para obtener imágenes de las estructuras más pequeñas de la materia, la TEM utiliza un haz de electrones que se transmite a través de una muestra, revelando la organización interna y la composición de un tejido, una célula u otro material.  
• Microscopía electrónica de barrido (SEM): al igual que otros métodos de microscopía electrónica, la SEM utiliza haces de electrones, pero la SEM examina la superficie y la composición de una muestra, en lugar de su interior.  

Otras técnicas de imagen

• Microscopía de fuerza atómica (AFM):esta técnica permite obtener imágenes a escala nanométrica de las superficies de materiales biológicos en su entorno natural. Con esta técnica, una sonda mecánica utiliza fuerzas eléctricas para generar movimientos minúsculos, pero precisos y exactos, mediante comandos (electrónicos) para realizar un escaneo preciso. 
• Cribado de alto contenido:abarca varios ensayos, a menudo con tintes fluorescentes, para visualizar las células y determinar sus funciones y operaciones. La resolución de las técnicas de microscopía de alto contenido ha superado a la de la microscopía tradicional, y estas técnicas incorporan imágenes y análisis automatizados para estudios a gran escala de las células.

Análisis de datos de imágenes celulares

Procesamiento de imágenes:existen varias técnicas disponibles para mejorar la calidad y la claridad de las imágenes. Además, las organizaciones científicas han elaborado listas de verificación para publicar imágenes microscópicas claras y de alta calidad. En primer lugar, en lo que puede parecer un paso obvio, asegúrese de que su microscopio esté correctamente alineado (condensador y lente) y utilice el ajuste correcto del diafragma (para microscopía óptica). También hay directrices disponibles para otros métodos, como la microscopía de fluorescencia. 

Christian Tischer, jefe de equipo del Centro de Ciencia de Datos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), destacó que «en el caso de la investigación basada en microscopía, esto abarca desde cuestiones como la legibilidad de los datos de las imágenes en las figuras de las publicaciones, el suministro de información sobre la escala y la elección responsable de los ajustes de contraste, hasta el intercambio de datos de imágenes en archivos públicos y el acceso a la cadena de análisis en plataformas de computación en la nube». 

The Aura system of particle analyzers combina tecnologías de luz (es decir, campo claro) y fluorescencia para crear ensayos más sensibles con imágenes de mayor resolución. El sistema también incluye Programas analíticos Particle Vue que ayudan a mejorar las imágenes y proporcionan datos cuantitativos y útiles.  

Análisis cuantitativo:las imágenes no sirven de mucho si no se pueden extraer datos cuantitativos de ellas. Existen varias herramientas que pueden contar las células y partículas de una muestra, evaluar la citotoxicidad con ensayos de células vivas/muertas, medir la autofagia, determinar fenotipos celulares como la forma, el tamaño y la estructura de las células, localizar moléculas específicas en las células y analizar procesos dinámicos a lo largo del tiempo.  

Interpretación de datos

Análisis morfológico — Determinar el tamaño, la forma y la estructura de las células y otras partículas y componentes en cultivo puede ayudar a evaluar la eficacia de los posibles tratamientos, así como ilustrar los cambios que se producen debido a la enfermedad. The Aura family of analyzers y Software analítico Particle Vue puede determinar con precisión la morfología y los cambios que se producen en las células sanas y enfermas, así como en las reacciones a los tratamientos farmacológicos. Un método habitual para determinar las células viables frente a las no viables consiste en teñir las células con DAPI y utilizar FMM en Aura para determinar la población de condiciones celulares. 

Localización molecular:determinar la ubicación exacta de moléculas específicas dentro de las células puede ayudar a determinar su papel en la salud, las enfermedades y las reacciones a los tratamientos. Estas técnicas, como el seguimiento de partículas individuales (SPT) y la microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM), pueden identificar moléculas a escala nanométrica y determinar las posiciones y el movimiento de proteínas y otras moléculas importantes dentro de una célula.  

Imágenes time-lapse:el seguimiento de las respuestas celulares durante un periodo de tiempo puede ayudar a determinar el momento adecuado para leer los ensayos finales, caracterizar la cinética celular de múltiples reacciones a la vez y realizar un seguimiento en tiempo real de los efectos de los tratamientos sobre las células. Las imágenes time-lapse automatizadas también pueden reducir drásticamente los tiempos de análisis.  

Técnicas analíticas avanzadas

Reconstrucción 3D:estas técnicas toman datos de imágenes y crean modelos tridimensionales de células y componentes celulares. El cultivo celular 3D (o construcción automatizada) proporciona una fisiología más relevante que las técnicas tradicionales de monocapa (2D).  

Imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM):esta técnica avanzada permite registrar simultáneamente la vida útil de la fluorescencia y la ubicación espacial de los fluorocromos en una imagen. FLIM puede ayudar a los investigadores a estudiar el pH, las concentraciones iónicas, la polaridad de los disolventes, las interacciones no covalentes, la viscosidad y la tensión de oxígeno en células vivas.  

Aplicaciones de las técnicas de imagen celular

Investigación en biología celular 

Estudio de la estructura y función celular:la estructura de los orgánulos y las membranas celulares es clave para comprender cómo se desarrollan las células y cómo se producen los procesos genéticos, fisiológicos y de desarrollo. Esto puede ser importante para comprender de forma básica cómo funcionan las células, pero también cómo se comportan en estados patológicos. Las imágenes también pueden ayudar a determinar la función de estas estructuras celulares. Las imágenes celulares en lapso de tiempo pueden ilustrar los cambios que experimentan (o activan) estas estructuras durante el desarrollo, la salud, la enfermedad y la muerte.  

Seguimiento de la dinámica celular:las técnicas de imagen ayudan a los investigadores a observar la migración, división y diferenciación celular, todo ello en tiempo real. Los procesos celulares abarcan múltiples escalas de tiempo y longitud, incluidos los procesos de desarrollo y la metástasis del cáncer. Existen diferentes técnicas que permiten determinar cómo funcionan estos procesos, ya sea en tiempo real, en tres dimensiones o en membranas celulares/subcelulares.  

Investigación médica 

Mecanismos de las enfermedades:las técnicas de imagen celular proporcionan una visión más clara de cómo surgen las enfermedades en una célula, cómo se apoderan de su función (en algunos casos) y, en última instancia, cómo pueden dañarla o matarla. Se está estudiando la microscopía tridimensional para ver si es posible observar los cambios en las células nerviosas durante la enfermedad de Alzheimer o el Parkinson, mientras que la microscopía de superresolución se utiliza para visualizar y cuantificar las proteínas de la membrana plaquetaria durante las respuestas inmunitarias. Se están utilizando otras técnicas de fluorescencia para visualizar cómo funcionan las terapias con células T CAR y para comprender mejor la muerte celular controlada.  

Descubrimiento y desarrollo de fármacos:obtener imágenes precisas y detalladas de la estructura y función celular en reacción a moléculas candidatas a fármacos es una parte crucial del descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias y vacunas para enfermedades. Técnicas como el sistema Aura de analizadores de partículas pueden utilizar FMM y BMI, combinando métodos de microscopía óptica y fluorescente para determinar cómo responden las células a los fármacos candidatos y qué otros factores moleculares y estructurales pueden estar interfiriendo en esa respuesta.  

Investigación genética 

Estudios de expresión génica:combinada con sofisticadas técnicas genéticas, como la secuenciación de última generación, la microscopía permite identificar los cambios fenotípicos que se producen con los cambios genotípicos. La microscopía electrónica permite identificar proteínas específicas y otros cambios moleculares, mientras que las técnicas de microscopía óptica y de fluorescencia pueden producir imágenes de cómo cambian las estructuras y funciones celulares en respuesta a las alteraciones genéticas. Los avances en la obtención de imágenes de células vivas permiten visualizar la expresión génica y las interacciones intracelulares en tiempo real. 

CRISPR e ingeniería genética:CRISPR-Cas9 es una herramienta de edición genética potente y versátil, pero también se puede utilizar para visualizar la replicación y las mutaciones del ADN en células vivas. La proteína Cas9, marcada con una proteína fluorescente, puede marcar un locus específico y visualizarse mediante microscopía. Otros científicos están estudiando cómo CRISPR puede desarrollar imágenes tridimensionales del genoma y retratos de cromosomas completos. Del mismo modo, la imagen molecular en la notificación y evaluación del estado de los injertos celulares, así como su relación con el microambiente local, los reemplazos celulares y/o los reemplazos genéticos, hace que la imagen celular sea una forma prometedora de determinar los efectos de las técnicas de ingeniería genética.  

Conclusión

Aunque la imagenología ha avanzado mucho en las últimas décadas, observar células y procesos subcelulares en alta resolución sin perder el contexto ambiental sigue siendo un reto, sobre todo de una forma mínimamente invasiva. La resolución celular, especialmente en contexto y en organismos vivos, aún necesita más desarrollo (hay varios proyectos experimentales en marcha). La observación de las proteínas en las células —incluida su estructura, cantidad, ubicación dentro de las células y actividad— puede realizarse con microscopía electrónica, pero se necesitan técnicas que permitan ver en tiempo real y que puedan ver moléculas más pequeñas. La recopilación y el análisis de datos necesitan normas más universales, y un mejor acceso global a estas tecnologías impulsará de forma espectacular la investigación científica.  

Referencias

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01987-9

https://www.nature.com/articles/s41592-021-01156-w?fromPaywallRec=false

https://www.nature.com/articles/d42473-022-00356-y

^DynabeadsTM es una marca comercial de Thermo Fisher Scientific.