AAV表征在确保基因治疗安全开发中的重要性

唐纳德-梅森

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腺相关病毒的图像

腺相关病毒（AAV）衣壳凭借其独特的安全特性和提供长期基因表达的能力，已成为体内基因递送的首选载体。随着多种血清型的重组AAV载体被应用于各类基因治疗项目，该领域正迎来空前发展。

截至2020年4月，全球共有244项涉及腺相关病毒（AAV）的基因疗法临床试验正在进行，其中24项处于III期临床阶段。即便如此，在工艺开发和最终药物产品评估中建立全面的AAV分析体系仍面临诸多挑战。

准确 AAV characterization 对确保基因疗法的有效性至关重要。可见的和 亚可见粒子（SVP） 分析在此过程中发挥着关键作用。然而，当应用于基于AAV的基因治疗时，由于可供测试的材料有限，分析面临着独特的挑战。 当前AAV表征方法包括动态光散射（DLS）和尺寸排阻色谱（SEC），这些技术通常用于表征可溶性亚微米级AAV群体。尽管这些技术信息量丰富，但由于主要关注可溶性稳定AAV，无法提供完整图景。研究不可溶性与不稳定AAV同样至关重要，这有助于识别潜在脆弱性或异常情况，确保其安全有效应用。

光遮蔽法（LO）和流场成像法（FI）等技术用于表征AAV制剂中的不溶性颗粒群体，可提供关于较大尺寸及异质性颗粒的信息。然而，这些方法需要大量样本，且成本高昂、耗时费力，成为基因治疗研发与生产中的瓶颈。

腺相关病毒的图像

传统与新型分析方法在AAV表征中的应用

确保腺相关病毒（AAV）基因疗法的一致性质量，取决于能否快速表征关键质量属性（CQAs）。 这包括病毒滴度、衣壳含量及聚集状态的测定——这些参数均会影响AAV的效力、纯度和安全性。遗憾的是，现有用于测定这些属性的AAV表征方法往往耗时过长或难以满足工艺开发需求，但新型快速、高通量的AAV分析方法正在研发中。

在近期发表于《Science Direct》的一项研究中，研究人员同时考察了传统与新兴的重组腺相关病毒（rAAV）质量属性测定技术。

rAAV作为有前景的基因治疗载体，其质量属性必须经过严格分析以确保安全性和有效性。传统的AAV分析与质量控制检测耗时较长，可能无法满足快速产品开发的时间要求。快速高通量AAV分析方法虽能迅速提供可操作结果，但受限于样本量少及基质效应的影响，其开发与实施仍面临挑战。

尽管存在这些挑战，在开发用于rAAV表征的快速、高通量分析方法方面仍取得了重大进展，尤其针对三项潜在关键质量属性（CQAs）：衣壳滴度、含量比和聚集体含量。如今可采用色谱法和光散射法直接或在线表征这些CQAs，从而实现工艺的实时监测与控制。

据论文作者所述，用于rAAV表征的快速高通量分析方法具有以下关键优势：

  • 加速产品开发：快速分析方法可通过及时反馈工艺性能和产品质量信息，助力加速产品开发进程。
  • 降低成本：快速分析方法可通过减少质量控制检测所需的时间和资源来降低成本。
  • 产品质量提升：快速分析方法通过实现实时过程监测与控制，有助于提升产品质量。

然而，挑战依然存在：

  • 样品量有限：rAAV生产通常仅能获得少量纯化产物，这可能限制可用于分析的样品量。
  • 基质效应：rAAV样本中其他分子的存在（如缓冲液、残留DNA或蛋白质、离子盐等）可能干扰分析测定。
  • 方法开发：开发快速、高通量且准确、可靠、可重复的分析方法具有挑战性。

作者得出结论：开发能够支持工艺开发中短周期和高通量需求，同时保持可重复性和特异性的AAV分析方法至关重要。

超越传统AAV表征方法：借助Aura深入解析样本特性

在超低体积条件下表征AAV的聚集特性与稳定性，对于实现产品纯度及防止DNA泄漏或污染至关重要。技术进步为该领域开辟了新可能，如今已能针对基因治疗开发所需的超低体积样本，快速筛查不稳定性并表征AAV聚集特性。 通过Aura系统侧向照明膜成像（SIMI）与荧光膜显微镜（FMM）技术，结合BMI折射率检测功能，可深入解析样本成分，识别蛋白质/非蛋白质物质及内源性/外源性元素——这是传统流式颗粒分析仪无法实现的。此技术能有效防范因隐性颗粒污染导致的高额召回风险。

与需要数毫升样本的流式成像不同， Aura Systems 仅需5微升样本即可快速便捷地表征病毒载体及其他类型基因疗法。这得益于膜显微镜技术——该技术仅需微量样本即可实现100%采样效率。

Aura GT System’s technology also allows for AAV characterization with high throughput (<1 min/sample), quickly revealing insights into their stability. The system helps to ensure that a gene therapy’s most important stability characteristic — its SVP concentration — can be monitored throughout process development and through quality control testing.

在多种应激条件下对AAV2载体进行了聚集性测试——（a）等效圆形直径（ECD）≥2微米的颗粒浓度；（b）被颗粒覆盖的膜面积百分比。
在多种应激条件下对AAV2载体进行了聚集性测试——（a）等效圆形直径（ECD）≥2微米的颗粒浓度；（b）被颗粒覆盖的膜面积百分比。

采用多种AAV分析方法

通过实施一种用于AAV表征的快速分析方法，您可以在开发过程中更早地启动候选物的筛选与选择工作，从而为基因疗法的商业化提供所需的信心保障。

参考文献

  1. McIntosh, N.L., Berguig, G.Y., Karim, O.A. 等 (2021). 通过尺寸排阻色谱和多角度光散射对腺相关病毒载体进行全面表征与定量分析。 《科学报告》，11卷，3012期。https://doi.org/10.1038/s41598-021-82599-1
  2. 科尔，L.，费尔南德斯，D.，侯赛因，M.T.，卡祖巴，M.，斯滕森，J.，及马尔科娃，N. (2021)。 利用正交技术表征基因治疗用重组腺相关病毒（rAAVs）。《药剂学》，13(4)，586。https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13040586
  3. Gimpel, A.L., Katsikis, G., Sha, S., Maloney, A.J., Hong, M.S., Nguyen, T.N.T., Wolfrum, J., Springs, S.L., Sinskey, A.J., Manalis, S.R., Barone, P.W., & Braatz, R.D. (2021). 重组腺相关病毒基因疗法工艺与产品表征的分析方法. 《分子治疗——方法与临床开发》, 20, 740-754.https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010