解码细胞培养污染——深度解析

细胞培养污染是每个实验室的噩梦。污染可分为物理性、化学性或生物性，其危害程度从轻微问题到灾难性后果不等。 

污染的解决方案包括遵守良好的实验室规范、保持高标准的清洁度和培养基管理、实施有效的清洁措施，以及采用诸如...等技术。 Aura+ System 检测并鉴定污染物，并可能查明污染源及其他补救措施。  

本分析将探讨污染控制的重要性、污染类型、颗粒污染的鉴定测试，以及各种检测与控制方法。 

细胞培养概述 

细胞培养——即在人工实验室环境中培育和维持活细胞的技术——是细胞与分子生物学领域最重要的技术之一。通过细胞培养，研究人员能够探索野生型、病变型及转基因细胞的生物学特性、化学反应、生理机能及代谢过程。  

永生癌细胞向研究人员揭示了癌症的发展机制（以及治疗或预防途径），而来自遗传性疾病患者的干细胞已成为研究疾病分子机制的宝贵平台——这一切都在培养皿中实现。细胞培养技术还被用于筛选新药化合物在特定细胞中的疗效与毒性，对开发再生组织、疫苗以及基因和细胞疗法具有不可估量的价值。  

细胞培养污染控制 

根据具体污染物的不同，美国食品药品监督管理局（FDA）和美国类型细胞收藏中心（ATCC）估计，多达30%的细胞培养物存在污染（至少受到支原体污染）。  

细胞培养污染的后果包括：实验和细胞生长延误，因需购买新细胞、培养基、血清及培养皿/容器而造成的经济损失，以及因需重新设置实验和培养新细胞而产生的劳动力成本。  

在药物研发过程中，隐性污染物可能改变细胞的生长与功能，影响其生产生物疗法和疫苗的能力。此类产品往往因此失去功效，且违反药物安全法规与标准。  

完全杜绝细胞培养污染或许难以实现，但通过采取正确的策略和工具，可将颗粒物及物理污染物控制在最低水平，从而避免培养物、实验及生产过程的损失。此类污染物堪称最大隐患，因其可能危及患者健康甚至导致死亡。 

For biotherapeutic production, USP <788> standards set biopharmaceutical lot release guidelines and the proper limits of subvisible particles of no more than 12 particles per ml at least 10 µm and no more than two particles per ml that are at least 25 µm. In biotherapeutics, these particles are usually protein or other molecular fragments.  The Aura System 是识别和表征某些细胞培养污染背后不可见颗粒的宝贵工具。  

污染风险评估 

确定细胞培养污染风险的关键在于全面评估培养体系的特性。这些特性包括内在因素——所用血清与培养基的类型，以及基因改造后细胞的特性——以及外在因素——病原体感染的可能性、其他蛋白质颗粒的污染风险，甚至来自其他培养细胞（例如HeLa细胞）的交叉污染风险。  

某些文化比其他文化具有更高的风险： 

• 降低风险——使用非人类或非灵长类动物的连续细胞系，或特性明确的人类连续细胞系。 
• 中等风险——使用表征不充分的哺乳动物细胞。 
• 高风险——使用来自人类或灵长类动物组织和/或血液的原代细胞。高风险细胞还包括含有内源性病原体的细胞。  

您还需对实验室操作规程进行全面审查，确保遵循良好实验室规范（GLP），定期使用适当消毒剂，对细胞培养物进行感染/污染检测，并配备能检测和定量分析不可见或亚可见病原体的专用工具。 

污染类型 

污染可能来自多种不同来源。对于大多数研究人员和开发人员而言，细菌和真菌通常是首先想到的常见污染物。其他类型还包括病毒、化学物质和大分子颗粒。  

• 微生物污染物——这些通常肉眼可见，会在培养基中迅速引起浊度和颜色的变化。其中包括细菌、真菌和酵母菌。其他入侵者，如支原体，则不易被检测到。  
• 病毒——这些是最难检测的污染物之一。病毒可能来自患者或宿主动物，某些生物技术细胞系中还含有内源性逆转录病毒。  
• 化学污染物——非生物性污染物，包括自由基、金属离子、消毒剂和洗涤剂残留物，或残留的细菌内毒素。对于生物治疗药物和疫苗开发者而言，这些污染物还可能包含蛋白质片段及其他大分子物质，这些物质伴随蛋白质类药物/疫苗的生产过程而产生，对生物制品开发者构成重大难题。  

痕量化学物质与金属的污染分析 

根据污染类型和所用细胞培养物的不同，污染分析可采用多种技术和工具。这些工具能检测、鉴定并表征细胞培养物中的污染物和外来物质。分析工具涵盖目视检查、显微镜观察、光谱分析、物理/化学检测及元素分析等。快速检测与分析是关键所在。  

显微镜技术（光学显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、电子显微镜）可提供污染物的形状、尺寸及表面信息，而光谱学及其他显微技术（如扫描电子显微镜与能量色散X射线光谱）则能确定污染物的化学成分。 拉曼光谱、荧光显微镜、光学显微镜及衰减全反射傅里叶变换红外光谱可揭示有机物的分子组成，而电感耦合等离子体光谱则能检测痕量金属。  

污染分析——鉴定测试 

确定化学和无机污染物可能较为困难，因为这些污染物比生物污染物更难检测。进行鉴定检测时，应首先关注问题出现前数周实验室发生的任何变化，特别是设备、耗材、溶液和培养基方面的变动。与实验室人员共同探讨，确定后续评估的最佳方向。 同时需重点分析可能的污染情景——尤其要结合细胞培养的风险特性进行评估。 

识别工作可从记录任何异常气味或味道（如适用）、色泽问题或异物颗粒开始。尽可能排除因不当储存和处理或劣质原料导致的污染。随后，即可开始使用能识别化学、物理或生物污染物的检测工具。  

颗粒污染分析 

颗粒物，尤其是亚可见颗粒（2至100微米），在生物制药注射剂和输注剂中较为常见，并与免疫原性密切相关，从而导致产品性能受损或失效。  

USP <788> and FDA standards and regulations establish lot release guidelines and limits for these particles. USP <788> describes two methods for particulate analysis—light obscuration and membrane microscopy. Membrane microscopy is recommended over light obscuration when working with complex, viscous and low-volume samples (a large proportion of biopharmaceutical drugs under development).  

一旦识别出微观颗粒，即可着手分离生产沉积物和聚集物中的颗粒相，并确定污染物的来源。 这些颗粒可能是蛋白质碎片，也可能是呈现为黑色斑点的外来颗粒、清洁维护残留化学品、溶解后出现的颗粒、来自管道/泵/容器的金属磨损或腐蚀物、工艺设备颗粒、剥离或破损产生的玻璃碎片、矿物质，或是各类塑料、橡胶、硅胶及其他聚合物。  

污染分析技术 

选择最佳的颗粒分析仪需根据具体应用需求而定，例如样品类型、粒径范围及分析目标。并不存在万能解决方案。不过，主流的颗粒分析仪通常采用激光衍射、动态光散射（DLS）或显微镜技术等方法。 The Aura Systems suite of analyzers 对于≥1微米的颗粒，可提供比动态光散射（DLS）或显微镜更详细的颗粒分析，通过生物体积测量（BMI）和功能性微粒测量（FMM）技术，能够发现并表征更多颗粒，包括其他方法无法检测到的亚可见颗粒。 

粒度分析 

几乎所有生物治疗药物都含有亚可见颗粒（直径介于2至100微米之间）。颗粒样品最重要的特性是粒径，这可能对最终产品的成功至关重要。大多数颗粒在体积和形状上存在差异。了解产品中的粒径分布有助于预测其可制造性、有效性、质量、生物利用度及保质期。 粒径分布会影响药物的多孔性与表面积——错误的粒径分布将干扰生产过程、降低产量并损害利润。 

检测方法 

激光衍射——亦称静态激光光散射法，该方法通过检测粒子散射的激光光强分布间接测量粒径。其无法评估形状（假设所有粒子均为球形），且存在分辨率低、灵敏度差的缺点。在多分散性样品中效果不佳。  

聚合酶链式反应（PCR）——这项广泛应用的技术可用于鉴定生物污染物的种类，例如支原体、病毒或细菌。 

动态光散射法（DLS）——该方法通过实时分析经过摄像头的颗粒物。DLS能在数分钟内检测数百万个颗粒，并提供多种粒径及形态参数数据。目前，DLS是生物治疗药物粒度分布分析中最常用的方法。  

成像（显微镜、扫描电子显微镜）——该方法通过将颗粒尺寸与网格线进行比对并计数来测量颗粒。然而，为获得具有统计学意义的分析结果，需测量数百万个颗粒。电子显微照片的自动化分析有助于降低这一门槛。该方法适用于粒径在0.2至100微米范围内的颗粒。 

BMI/FMM—Backgrounded membrane imaging (BMI)结合 荧光膜显微镜 (FMI)，是该体系的基础。 光晕粒子分析系统高对比度成像技术（BMI）能清晰呈现样本中的颗粒图像。该技术仅需5微升样本，一分钟即可出结果。荧光微阵列（FMM）通过特定荧光染料或抗体标记颗粒，实现简便而确切的识别。 

比较方法 

显微技术——包括光学显微镜、电子显微镜和X射线衍射技术——能够揭示污染物的尺寸和形态，但可能无法检测亚可见颗粒。 PCR虽灵敏，却无法检测蛋白质碎片或化学/物理污染物。BMI结合FMM技术及侧向照明膜成像（SIMI）——作为Aura系统的核心技术——可轻松、快速且精准地识别细胞、基因及蛋白质疗法中的颗粒物。 

BMI技术——为以往难以察觉的配方风险提供清晰视角。该技术源于膜显微镜技术，但实现了重大突破。首先拍摄膜的背景图像，随后将样品过滤通过并捕获颗粒。接着对附着颗粒的膜进行二次成像，最后通过背景图像减法消除背景纹理，从而清晰呈现颗粒分布。  

FMM——与BMI协同工作，实现其他颗粒分析系统无法企及的分析深度。您可直接在膜上或溶液中，使用特定荧光染料或抗体标记目标。首先通过BMI对膜进行成像以定位颗粒，随后运用FMM对颗粒本身进行表征。  

SIMI——通过检测光散射现象（特别是高折射率颗粒，包括从膜表面突出的颗粒）协同BMI和FMM技术工作。散射光的颗粒表明膜表面存在玻璃或塑料等无机物突起；吸收光的颗粒则提示存在金属颗粒（如残留^{的Dynabeads™}）及同样从膜表面突出的吸光油类物质。 

一例诊断病例研究 

最近，沃特斯公司的科学家们使用了 Aura+ System 通过BMI、FMM和SIMI技术检测并表征颗粒，结果表明Aura+系统在区分细胞疗法中的亚可见颗粒方面优于其他方法。鉴于美国食品药品监督管理局近期就Kymriah®细胞疗法中木质、纤维素、黄铜和钢材污染问题发布483表格（推测污染源自冷冻保存袋），该技术在治疗开发中的重要性日益凸显。 

研究人员将CAR-T细胞与NIST颗粒标准品、纤维素及金属颗粒混合。采用Aura+系统以SIMI模式分析了与Dynabeads混合的CAR-T细胞。通过BMI、FMM和SIMI技术协同分析，成功实现了复杂颗粒-细胞混合体系的全面颗粒检测——研究人员发现了四类颗粒亚型：塑料颗粒、非活细胞、活细胞及蛋白质聚集体。  

污染控制与去污 

值得庆幸的是，良好的实验室规范（GLP）在控制培养物污染的频率和程度方面成效显著。主动管理培养物以减少问题发生至关重要，同时需对任何问题（无论多么细微）进行至少一个月的准确记录。 

其他经过验证的避免污染的方法包括： 

• 良好的无菌操作技术——在细胞与环境之间建立屏障。 
• 减少事故——确保减少泼洒、破损或泄漏。 
• 保持实验室清洁——减少生物、化学甚至物理颗粒的进入。 
• 常规监测——记录任何出现的问题。 
• 避免使用抗生素——抵御耐药菌株 

然而，正确使用消毒剂（作为实验室清洁工作的一部分）有助于防止污染。 

实验室标准，质量控制 

Standards for laboratory practice fall under GLP methods, and quality controls are dictated by FDA standards, based on USP <788>. 

USP <788>:  Specifically outlines the requirements for particle size limits (between 10 and 25 µm) and methods of particulate matter determination in injections for various dosage forms.  

GLP：在美国，这些实践规范遵循《联邦法规》第21卷第58部分的规定。欧洲共同体以及亚洲、非洲、美洲和中东地区的关键国家也遵循这些标准。根据美国食品药品监督管理局（FDA）的定义，GLP为开展严格控制的研究提供了框架： 

• 确保数据的质量和完整性 
• 促进学习重建 
• 承担全面责任 
• 新化合物首先通过非临床研究进行安全性测试 

Aura系统污染检测 

Aura Systems系列颗粒检测分析仪采用明场与荧光成像技术结合光散射原理，可精准识别并定量分析细胞培养污染物。该技术所需样本量小于其他方法，能为您的细胞培养提供更准确、更精确的读数。Aura Systems系列包括：  

• Aura+ System跨学科生物治疗一体化系统。 

• Aura CL System: 对于细胞疗法，能够识别细胞聚集体并进行细胞检测 

• Aura GT System: 对于基因治疗，可识别衣壳聚集体、检测DNA泄漏、进行免疫测定 

• Aura PTx System: 针对免疫（抗体）疗法，鉴定聚山梨酯，并进行免疫测定。 

参考文献

细胞培养：体外培养细胞作为模型系统https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7149418/#:~:text=Cell%20culture%20is%20one%20of,type%20cells%20and%20diseased%20cells. 

FDA与GLPhttps://www.fda.gov/media/165993/download 

USP <788> https://www.uspnf.com/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/revisionGeneralChapter788.pdf 

细胞培养中的病毒污染https://rdcu.be/dMCh0 

^Dynabeads™是赛默飞世尔科技公司的注册商标。