蛋白质鉴定与表征全指南

蛋白质鉴定与表征是生物制剂重组蛋白表达与生产过程中最重要的环节之一。由于蛋白质本身的高度复杂性——由21种氨基酸以近乎无限的方式排列组合，进而折叠成三维结构——该过程需要运用多种分析工具与技术手段。  

理解蛋白质的结构是理解其功能的关键，而生物疗法的开发——包括抗体、重组蛋白、疫苗及其他分子——则依赖于清晰而准确的特性表征。 

蛋白质鉴定方法 

• 质谱分析（MS）——完整 蛋白质首先被电离，随后进入质谱分析器，或在肽段水平进行鉴定。质谱仪通过质谱指纹或串联质谱技术识别蛋白质结构。肽段质量与在线数据库进行比对，以获得最接近的蛋白质匹配结果。 
• 埃德曼降解法—— 通过苯基异硫氰酸酯从肽链氨基端逐个残基去除，实现 蛋白质纯化。 该过程不会损伤蛋白质，且能逐个残基分离，但对较大蛋白质的适用性较差。   
• 肽质谱指纹分析——这种 高通量方法利用内肽酶将未知蛋白质切割成较小的肽段。通过质谱仪测量这些肽段的质量，并将得到的"肽峰"列表与蛋白质数据库进行比对。  
• 数据库检索与生物信息学工具—— 通过计算机程序和数据库对质谱（MS）及指纹图谱数据进行比对，以寻找与您的样本最接近的匹配结果。  
• 免疫测定法——通过蛋白质与特异性抗体的相互作用来识别蛋白质。这类检测包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（通过分子量分离蛋白质，经电泳转移至膜上，再用抗体进行探测）以及免疫沉淀法（利用特异性结合该蛋白的抗体，将蛋白质抗原从溶液中沉淀出来）。 
• 尺寸排阻色谱（SEC）—— 该方法利用 填充在色谱柱中的特定尺寸树脂珠，根据蛋白质尺寸进行分离。当样品进入色谱柱时，不同分子将呈现不同的洗脱速率。  
• 亲和层析——该技术同样采用色谱柱和纤维素珠。底物（或有时为辅酶）通过共价键结合在色谱柱顶部的珠粒上。具有与固定化底物结合位点的蛋白质将发生结合，其余所有蛋白质则被洗脱。 

蛋白质表征技术

蛋白质表征旨在阐明蛋白质的一级序列、高阶结构、翻译后修饰、相互作用及生物活性。该过程涉及多种分析工具与技术手段。 对于具有不同聚集状态、电荷、尺寸及三维构象的大分子，不存在能"一刀切"确定其化学组成、结构和功能的技术。但对样本中的蛋白质（尤其是潜在治疗药物）进行表征，对于确定蛋白质疗法的安全性、有效性和纯度至关重要。  

蛋白质分析设备 

蛋白质分析涉及检测、纯化和鉴定蛋白质的工具，并开始表征其结构与功能。相关设备包括传统方法如电泳（通过大小和电荷分离蛋白质）、蛋白质印迹（用抗体标记目标）以及质谱分析（测量质量电荷比）。更现代的方法则包含动态光散射（DLS）。  

• 蛋白质分离（电泳）将蛋白质置于凝胶中，在电场作用下观察其迁移情况。蛋白质可通过溶解度、大小、电荷及结合特性进行分离。最常见的是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），该方法基于分子量对蛋白质进行分离。  
• Western blotting技术通过提取细胞中的蛋白质，按分子量进行分离，将其转移至固相载体（即印迹膜），再利用一抗和二抗靶向结合目标蛋白，从而基于生物学关联实现蛋白质的鉴定。  
• 光散射 是一种更现代的方法，对大分子更敏感。例如，动态光散射法能灵敏检测制剂中微量多肽聚集体。Aura Systems系列仪器 基于背景校正膜成像（BMI）和荧光膜显微镜（FMM）技术，可精确 测量颗粒尺寸分布。这些仪器能提供样品中颗粒尺寸分布的宝贵信息，助力科研人员和制造商深入理解产品特性。 

生物制剂配方仪器 

在治疗性分子的生产过程中，配备合适的仪器设备至关重要，这些设备能监测蛋白质构象、预测热稳定性并测量聚集物形成。  

差示扫描量热法（DSC） 通过测量分子热诱导结构转变的焓变（ΔH）和熔解温度（Tm），表征蛋白质的热稳定性。动态光散射（DLS）可利用电泳光散射（ELS）技术分析颗粒迁移率和电荷（Zeta电位），并通过静态光散射（SLS）测定溶液中颗粒的分子量。其他系统，如 Aura PTx System使用 身体质量指数 具有两个通道的 FMM 用于检测和识别可能形成聚集体并威胁生物制品稳定性的亚可见颗粒。此外，FMM还能表征制剂辅料，例如聚山梨酯。 

蛋白质表征工具 

色谱法：高效液相色谱（HPLC）、凝胶渗透色谱（SEC）、离子交换色谱（IEC）及亲和色谱通过蛋白质的尺寸、电荷、疏水性或特定相互作用进行分离，从而实现纯度分析及蛋白质同工型或变体的分离。 

电泳技术：SDS-PAGE、等电聚焦（IEF）和毛细管电泳（CE）通过蛋白质的大小、电荷或等电点进行分离，从而促进纯度分析、亚基组成鉴定及翻译后修饰研究。 

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）与基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）可识别并定量分析蛋白质、肽段及翻译后修饰，从而阐明其一级序列、结构变异及相互作用。 

光谱学：紫外-可见（UV-Vis）光谱、荧光光谱、圆二色性（CD）以及核磁共振（NMR）光谱技术可用于蛋白质结构分析，同时也能分析其折叠过程、构象变化及配体结合情况。 

The Aura Systems family （特别是用于蛋白质的Aura PTx系统）结合了生物分子成像（BMI）、显微镜技术以及荧光膜显微镜技术，通过荧光染料或抗体实现更快速、更可靠的表征，所有操作均可在单台仪器上完成。借助Aura系统，研究人员能够全面掌握所制备蛋白质的稳定性和纯度。 

蛋白质表征检测 

生物物理测定法：动态光散射（DLS）和差示扫描量热法（DSC）用于表征蛋白质的尺寸、构象、稳定性及其与配体或其他分子的相互作用。 

免疫学检测：酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blotting）、免疫沉淀法及流式细胞术可检测并定量分析蛋白质、表位或特定蛋白质-蛋白质相互作用，从而促进免疫检测、生物标志物检测及蛋白质-蛋白质相互作用研究。 

蛋白质配方 

蛋白质（氨基酸）初级结构的组装过程，继而形成次级结构和三级（三维）结构，最终制成药用蛋白质产品，其间需确保稳定性、结构完整性和功能性的关键步骤。蛋白质必须经过稳定化处理，使其能够耐受生产工艺，并在运输、储存和给药过程中保持稳定活性。 制剂开发旨在通过选择合适的辅料、缓冲液、pH值及剂型，确保生物制药产品的稳定性、有效性、安全性及可生产性。 

影响稳定性和有效性的因素包括聚集体形成，其会改变蛋白质结构（进而影响功能）。要理解不稳定性的根本原因，必须将聚集的活性药物成分（API）与其他颗粒类型区分开来。  The Aura PTx System’s  96孔聚集体与颗粒成像系统可快速测量颗粒尺寸、计数并表征其特性，同时识别其为蛋白质、非蛋白质、赋形剂或其他类型分子。该系统在区分蛋白质尺寸与计数方面，较传统流式细胞系统更具效率与精准度。  

蛋白质聚集分析 

蛋白质样本中的聚集体通常是断裂的多肽链片段，这些片段在制造蛋白质疗法时会"顺带产生"。然而，它们会显著降低目标蛋白质的稳定性，并削弱治疗药物的疗效。此外，接触空气、固体、光照或温度变化（这些常出现在药物研发过程中）也会产生蛋白质颗粒。 

成功的蛋白质疗法需要在后期发现/早期开发阶段进行产品质量检测，以识别、计数和表征制剂赋形剂，确保蛋白质稳定性。但传统方法需要耗费数小时筛选图像、处理较大样本量，并采用复杂的机器学习库，且常会遗漏关键样本聚集体和降解化合物。 Aura PTx System该系统通过结合BMI与两个FMM通道，可快速提供计数、尺寸及形态数据，并能区分细胞聚集体、蛋白质聚集体或外源性聚集体。 

分子量表征 

通过分子量表征蛋白质的技术包括SDS-PAGE、MALDI-TOF质谱以及SEC或SEC-MALS。SDS-PAGE是最常用的技术，它根据分子量（而非电荷或折叠状态）分离蛋白质。 该技术广泛应用于生物化学、法医鉴定、遗传学及分子生物学领域。MALDI-TOF作为质谱分析技术，通过测定质量电荷比来确定蛋白质的质量及元素组成。 自MALDI技术问世后，该方法迅速成为蛋白质研究的主流手段。SEC（凝胶过滤色谱/高效液相色谱）作为强有力的分析技术，广泛应用于胰岛素、单克隆抗体等生物治疗蛋白的研发与生产过程中的聚集体及片段分析。  

高效液相色谱纯度分析 

如前所述，高效液相色谱法（HPLC）用于蛋白质纯度研究。该技术能实现样品物质的高选择性分离。HPLC通过凝胶过滤原理，依据分子尺寸进行分离。凝胶由微珠构成，其孔径具有特定的尺寸分布、电荷特性及/或亲和力。 当不同尺寸、电荷或亲和力的分子被基质孔隙选择性地吸附或排斥时，分离过程便得以实现。较大分析物将率先洗脱，而较小分子因与固定相产生更多相互作用，则会延迟洗脱。 

蛋白质电荷变体分析 

大型生物治疗蛋白在生产过程中可能经历酶促翻译后修饰，例如糖基化与赖氨酸截短。此外，在纯化和储存阶段也可能发生化学修饰。因此，FDA等监管机构要求对这类蛋白质进行电荷变体分析。传统上该分析采用盐梯度离子交换色谱法，而新型技术则依赖pH梯度替代盐梯度。 电泳等电聚焦作为快速整体分析法也被采用，但其运行时间较长且易受人为操作影响。该方法通常要求样品纯度极高，因其难以处理受污染或异质性样品。  

聚合与片段内容分析 

聚集体和碎片是生物制药中的常见杂质，会影响产品的疗效、安全性和稳定性。可将凝胶渗透色谱（SEC）与电喷雾电离质谱（ESI-MS）联用，用于表征治疗性单克隆抗体（mAbs）的尺寸变体。四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）也可通过优化实现更高灵敏度。 此外，分析型超速离心技术可辅助分离片段。 

宿主细胞蛋白质残基的鉴定与定量 

宿主细胞蛋白是生物治疗药物生产过程中宿主生物产生的杂质。纯化通常能从最终产品中去除大部分残留物，但即使低水平残留的蛋白质仍可能与制备的抗体疗法结合，产生免疫原性。 当前FDA等监管机构要求生物治疗终产品中蛋白质杂质含量近乎为零。质谱技术可有效鉴定和定量重组治疗产品中残留的宿主细胞蛋白，较ELISA等分析方法更具优势。Aura PTx系统中的BMI和FMM显微分析技术同样能高效检测蛋白质及聚集物。  

序列覆盖率/肽图谱分析 

确定治疗性蛋白质的精确序列对成功表征至关重要。该方法通过将蛋白质消化至基本肽段，确保获得生物治疗分子的完整序列。序列覆盖与肽图谱分析技术包括高效液相色谱（HPLC）及其与质谱联用技术。质谱技术可提供高精度、高选择性的数据，尤其适用于单克隆抗体等高度复杂的生物分子。  

N端和C端序列确认 

氨基（N端）序列分析可确定蛋白质从N端开始的氨基酸排列顺序。 N端序列显著影响蛋白质的半衰期、亚细胞定位及翻译后修饰。同理，C端（酸性末端）序列分析则确定蛋白质C端末端的氨基酸排列顺序，可提供有关蛋白质折叠、二级结构及功能域排列的信息。目前主要采用质谱分析（MS）和埃德曼降解法（Edman Degradation）两种方法进行序列确认。  

翻译后修饰分析 

蛋白质翻译后修饰（PTMs）是指蛋白质表达后引入的变异。表观遗传学研究表明，PTMs可能无害，也可能显著改变蛋白质功能，因此在任何生物治疗产品中检测PTM效应都至关重要。 常见的PTM涵盖从简单到复杂的多种形式，包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化及蛋白水解。这些修饰通常由酶促反应（酶的作用）引发。 不同类型的PTM需采用差异化检测分析技术，包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting蛋白质印迹、染色质免疫沉淀（ChIP）等方法。  

二硫键分析 

二硫键是氨基酸半胱氨酸残基中硫原子之间的共价键。它们是多肽链间唯一的共价连接，能稳定蛋白质结构。 还原剂如三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、β-巯基乙醇(BME)和二硫苏糖醇(DTT)可破坏二硫键，从而影响蛋白质稳定性。二硫键分析通常通过质谱(MS)和高效液相色谱(HPLC)进行。  

糖基化修饰分析 

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰（PTM），可改变蛋白质的折叠、构象、分布、稳定性和活性。 糖基化通过向蛋白质添加多种糖类，进而调控细胞与细胞外基质的黏附以及细胞内的蛋白质-配体相互作用。糖蛋白的检测、纯化和分析依次通过以下步骤实现：糖链染色与可视化、糖链交联至琼脂糖或磁性树脂进行标记或纯化，或通过质谱（MS）进行蛋白质组学分析。  

糖基化位点与糖型分析 

糖基化会因糖分子在细胞中的结合位置、糖分子的结构及其化学结合位点而产生差异。这些寡糖可通过允许或阻断蛋白质与对应的相互作用域结合，从而影响蛋白质-蛋白质相互作用。由于其亲水性特性，它们还能改变蛋白质的溶解度。分析技术包括糖链染色、利用凝集素进行富集与分析，以及质谱分析。 

唾液酸分析 

神经氨酸是哺乳动物细胞表面最常见的糖类。它们对细胞黏附和免疫调节至关重要，并能与选择素和凝集素结合。ICH Q6B指南要求对生物制药生产过程中的神经氨酸和单糖进行分析。通常采用荧光标记法结合高效液相色谱（HPLC）荧光检测进行神经氨酸定量分析。  

概述：蛋白质表征技术 

蛋白质堪称活细胞和组织中最复杂的分子，将其应用于生物制药时，需要整合多种技术进行全面分析，以确保其安全性和有效性。  

多发性硬化症特征分析 

如前所述，质谱技术是表征和分析蛋白质及其片段、聚集体和翻译后修饰（PTMs）的宝贵工具，这些因素均可能影响蛋白质的发育与稳定性。质谱技术可用于确定蛋白质的结构、功能、折叠状态及相互作用，从大量肽段碎片中识别蛋白质，并精确统计样本中的蛋白质数量。 过去二十年间，高通量与定量质谱蛋白质组学的兴起，极大拓展了质谱技术的应用疆域。 

圆二色性光谱表征 

圆二色性（CD）通过测量不同波长下光学活性化合物对左旋与右旋圆偏振光的吸收差异来实现。入射样品的光线在左旋圆偏振光（LCP）与右旋圆偏振光（RCP）间交替切换。当入射光的偏振方向改变时，其吸收特性随之变化，从而可计算出差异摩尔吸光系数。 圆二色性技术可研究蛋白质的二级结构变化，为构象分析奠定基础。该技术还能在pH值、变性剂、温度等条件下，检测蛋白质/核酸的稳定性（包括折叠、展开和重折叠过程）。  

FMM/SIMI/BMI 

构成Aura系统所进行的蛋白质及蛋白质片段分析的基础。 Aura PTx System是首个也是唯一一个将以下功能结合的系统： BMI) 与两个 FMM) 通过多种检测通道快速提供细胞计数、粒径分布、分子识别、成像及形态学分析，实现对细胞与蛋白质聚集体、辅料（如降解的聚山梨酯）的差异化检测，并可进行外源性颗粒表征。 

DLS 

动态光散射（DLS）技术用于测量0.2纳米至10微米范围内的颗粒。该仪器基于布朗运动原理工作——较轻的颗粒运动速度快于较重的（即较大）颗粒。激光照射颗粒后，通过分析散射光的强度波动来确定样品中的粒径分布。 

通过X射线晶体学表征 

X射线晶体学基于捕获X射线穿透目标分子（本例中为蛋白质）结晶形态时的图像。这是确定蛋白质三维结构的精确方法。采用该技术时，晶体学家需获取蛋白质晶体，记录X射线穿透晶体形成的衍射图样，再通过计算机软件对数据进行解读。 最终可获得具有原子分辨率的蛋白质模型。 

核磁共振光谱表征 

核磁共振（NMR）发生于静止磁场中的原子核受到振荡磁场扰动时；原子核会产生电磁信号，其频率取决于施加的磁场强度。核磁共振与X射线晶体学、低温电子显微镜并称为解析蛋白质结构的三种技术。不同于核磁共振成像，蛋白质核磁共振通过算法构建目标样本的三维模型。 蛋白质核磁共振实验需在完全纯化的样品上进行。 

冷冻电子显微镜表征 

另一种能够解析蛋白质结构的技术——冷冻电镜（cryo-EM），正成为获取高分辨率膜蛋白结构的新兴技术。这在核磁共振（NMR）或X射线晶体学等其他技术中是无法实现的。 冷冻电镜包含单粒子分析（SPA）、冷冻电子断层扫描（cryoET）和微电子衍射（MicroED）等多种应用形式。该技术已在结构生物学、传染病研究和药物发现领域引发革命性变革。 

推进蛋白质表征 

鉴于蛋白质的复杂性（更不用说其重要性），必须开发综合性方法，将多种技术结合起来进行全面分析和蛋白质表征。未来表征趋势似乎在于实现更高通量和更优的原子级分辨率，同时具备快速可靠地鉴定非蛋白质、蛋白质片段及聚集物的能力——尤其随着更多基于蛋白质的生物治疗药物被开发并进入市场。  

参考文献

https://www.usp.org/biologics/proteins

https://www.biopharminternational.com/view/usp-standards-to-support-the-characterization-of-mabs-applications-and-general-chapter-129