Amélioration, rétention et séparation des composés polaires à l'aide de techniques chromatographiques

La séparation et la rétention des composés polaires sont des défis importants en chromatographie. Nous explorons ici les considérations techniques clés et les solutions pour traiter efficacement ces composés, en nous concentrant sur les techniques chromatographiques avancées et les technologies de colonne. 

Que sont les composés polaires ? 

Les composés polaires sont essentiels dans les processus biologiques, la conception de médicaments et les applications industrielles en raison de leur capacité à interagir avec l'eau et d'autres substances polaires. Ils jouent un rôle essentiel dans la solubilité et le métabolisme des médicaments, y compris l'ADN et les protéines. 

Les composés polaires ont des charges positives et négatives distinctes aux extrémités opposées. Plus la distance entre ces charges est grande, plus le composé est polaire. Cette polarité complique leur rétention et leur séparation par les méthodes traditionnelles de chromatographie en phase inversée, généralement conçues pour les composés non polaires. 

Étant donné que les composés polaires s'attirent naturellement en raison de leurs charges opposées, comment faire interagir un composé polaire avec une phase stationnaire non polaire ? Cela nécessite un examen minutieux des conditions chromatographiques.  

Techniques chromatographiques pour l'analyse des composés polaires 

• Chromatographie liquide haute performance en phase inversée (RP-HPLC) : Elle se compose d'une phase mobile polaire, généralement un mélange d'eau ou d'eau tamponnée combiné à des solvants non polaires tels que le méthanol, l'acétonitrile ou le tétrahydrofurane. La phase stationnaire est non polaire et est créée en liant une fonctionnalité d'hydrocarbure à longue chaîne à un support de particules de silice, de noyau solide, de polymère ou hybride. Cette technique fonctionne bien pour les composés non polaires et nécessite les outils adéquats pour traiter efficacement les analytes hautement polaires. 
• Chromatographie en mode mixte : Bien qu'il existe différents types de chromatographie en mode mixte (techniques qui utilisent plusieurs mécanismes de séparation pour séparer efficacement les analytes), la chromatographie d'échange d'ions en phase inversée ( ) est couramment utilisée pour l'analyse des analytes polaires, y compris la purification des protéines, et combine les mécanismes de phase inversée et d'échange d'ions pour améliorer la rétention des composés polaires tout en prenant en compte les analytes non polaires. Contrairement à la chromatographie par échange d'ions, qui utilise une phase stationnaire avec des groupes fonctionnels chargés négativement pour attirer et lier des molécules chargées positivement (cations) de l'échantillon, la chromatographie par échange d'ions en phase inversée combine à la fois la phase inversée et l'échange d'ions pour améliorer la rétention des composés polaires tout en acceptant les analytes non polaires.   
• Chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) : Technique chromatographique complémentaire de la CLHP en phase inversée, la HILIC est utilisée pour améliorer la rétention d'analytes très polaires. Une phase mobile riche en acétonitrile et à faible teneur en eau, associée à une phase stationnaire polaire, améliore cette rétention, permettant aux analytes d'éluer par ordre croissant d'hydrophilie ou de polarité. 

Chacune de ces approches est efficace pour l'analyse des composés polaires dans certaines conditions, en fonction de la polarité et de la charge de l'échantillon. Voyons cela de plus près. 

Chromatographie liquide haute performance en phase inversée (RP-HPLC) : Obstacles et solutions 

La chromatographie liquide en phase inversée (RP-HPLC), couramment utilisée avec des colonnes C18, est généralement utilisée pour les composés non polaires et se heurte souvent à des difficultés avec les analytes hautement polaires, ce qui complique la rétention et la séparation. Cette méthode présente plusieurs limites, notamment 

• Rétention inadéquate: Les colonnes C18 peuvent ne pas retenir efficacement les analytes très polaires. 
• Agents d'appariement des ions: Ces agents peuvent améliorer la rétention mais nécessitent souvent de longs temps d'équilibrage et peuvent ne pas être compatibles avec la spectrométrie de masse (MS). 
• Mouillage: Ce phénomène se produit lorsque la phase mobile aqueuse est expulsée des pores non polaires, ce qui entraîne une perte de rétention. 

Afin d'améliorer la rétention des analytes polaires dans la CPL-RP, Waters a développé des technologies CPL-RP améliorées qui optimisent la densité des ligands et la taille des pores : 

• Colonnes T3: Ces colonnes présentent une densité de ligands C18 plus faible et des pores plus grands, ce qui réduit le mouillage et améliore la rétention des analytes polaires. 
• CORTECS T3 Columnssont compatibles avec des conditions 100 % aqueuses et offrent une excellente forme de pic sur une large gamme de pH. 

Extension de la sélectivité et amélioration de la rétention grâce à la chromatographie en mode mixte 

La chromatographie en mode mixte offre une plus grande flexibilité dans le développement des méthodes en permettant de modifier la composition de la phase mobile, y compris le pH du tampon, la force ionique et la teneur en solvant organique. Toutefois, les colonnes traditionnelles à mode mixte présentent plusieurs difficultés : 

• Problèmes de reproductibilité : La variabilité d'un lot à l'autre peut entraîner une rétention et une séparation incohérentes. 
• Adsorption non spécifique (NSA) : les pertes d'échantillons sont dues à des interactions indésirables entre les acides polaires et la surface de la colonne, ce qui réduit la récupération et la précision. 

Pour surmonter ces limitations, Waters a développé des technologies avancées de modes mixtes qui améliorent la performance et la fiabilité des colonnes - éliminant le besoin d'agents d'appariement d'ions, simplifiant la préparation de la phase mobile et améliorant la compatibilité avec la spectrométrie de masse. En outre, l'ajustement de la force ionique de la phase mobile, du pH ou de la composition du solvant organique permet d'améliorer la sélectivité.  

Améliorer la compatibilité LC-MS avec la chromatographie HILIC 

La méthode HILIC améliore la rétention et la séparation des analytes hautement polaires en utilisant une phase stationnaire polaire et une phase mobile riche en acétonitrile. Elle est idéale pour les sucres, les métabolites, les acides aminés et les pesticides polaires, pour lesquels les méthodes en phase inversée peuvent s'avérer difficiles. Bien que le schéma d'élution HILIC ressemble à la phase normale, il utilise un système de solvant organique-aqueux en phase inversée qui aide à surmonter certains des défis de la chromatographie en phase normale :   

• Solubilité limitée de l'analyte 
• Exigences du système LC dédié 
• Reproductibilité médiocre de l'essai 
• Compatibilité limitée avec la spectrométrie de masse par électrospray 

Pour répondre à ces défis de la phase normale, Waters a développé des technologies avancées qui améliorent la rétention, la sélectivité et la reproductibilité tout en améliorant la compatibilité avec les applications LC-MS.  

• HILIC : En utilisant de fortes concentrations de phase mobile organique (typiquement >80% d'acétonitrile), HILIC fournit une forme de pic optimale, une plus grande sensibilité et une performance améliorée de la spécification de masse. 
• Atlantis Premier BEH Z-HILIC Columns: Cette colonne comporte un ligand sulfobétaïne zwitterionique, qui permet une rétention accrue et une sélectivité unique pour les composés polaires. Elle incorpore également Technologie MaxPeak HPSy, qui minimise NSA. 

Considérations clés pour les chromatographes : Meilleures pratiques pour des résultats fiables  

Pour obtenir des résultats chromatographiques cohérents et de haute qualité, il faut prêter attention aux détails lors de la préparation et de la mise en œuvre de la méthode. Ces conseils pratiques vous aideront à optimiser la forme des pics et la reproductibilité des différentes techniques de chromatographie. 

• Préparation de la phase mobile: Utiliser des tampons aqueux pour former une couche d'eau stable sur la phase stationnaire, ce qui est crucial pour l'HILIC. 
• Équilibrage de la colonne: Laisser suffisamment de temps pour l'équilibrage afin de garantir des résultats reproductibles. La méthode HILIC peut nécessiter plus de temps que les méthodes en phase inversée. 
• Diluant de l'échantillon: Adapter le diluant de l'échantillon aux conditions initiales de la phase mobile afin de maintenir la forme et la surface des pics. Pour l'HILIC, un mélange acétonitrile-méthanol 75/25 est recommandé pour la plupart des analytes polaires. 

La rétention et la séparation efficaces des composés polaires nécessitent une compréhension approfondie des défis qui leur sont propres et l'application de techniques chromatographiques avancées. En tirant parti de technologies de colonnes améliorées et en optimisant les méthodes chromatographiques, vous pouvez obtenir une meilleure rétention et une meilleure séparation des analytes polaires, ce qui permet d'effectuer des analyses plus efficaces et plus précises. 

Ce blog présente une vue d'ensemble de haut niveau, mais notre webinaire à la demande offre une plongée plus profonde dans chaque technique chromatographique, vous fournissant les détails nécessaires pour affiner votre application afin d'obtenir les meilleurs résultats. Vous ne savez pas quelle colonne convient à votre composé polaire ? Consultez la rubrique Column Selection Guide for Polar Compounds. 

Ressources supplémentaires

• Column Selection Guide for Polar Compounds 
• Dépasser les limites de la rétention et de la séparation des composés polaires Webinaire