Méthodes de caractérisation biophysique

La caractérisation biophysique des protéines est une étape nécessaire dans la production et le développement de protéines thérapeutiques, car elle permet de comprendre de manière exhaustive la fonction et la structure d'une protéine. En analysant et en définissant la structure d'ordre supérieur des cibles médicamenteuses potentielles, ce processus permet d'identifier et d'atténuer les problèmes susceptibles d'avoir un impact significatif sur l'efficacité et la sécurité d'un produit, tels que la mauvaise stabilité et l'agrégation.^1,2

De plus, la caractérisation biophysique est un outil essentiel dans les premières étapes de la découverte de médicaments, car elle facilite l'identification et l'évaluation des cibles thérapeutiques potentielles et de leur interaction avec les composés thérapeutiques. Grâce à ses informations cruciales sur la dynamique structurelle des protéines thérapeutiques, la caractérisation biophysique joue un rôle clé dans l'optimisation du processus de conception des médicaments et garantit que les traitements susceptibles de sauver des vies sont développés dans un souci de sécurité et d'efficacité.³

Techniques courantes de caractérisation biophysique

En matière de méthodes biophysiques pour la caractérisation des protéines, les chercheurs disposent de nombreuses options pour analyser la structure secondaire et tertiaire d'une molécule, ainsi que son agrégation. 

Structure secondaire et tertiaire

• Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) : cette technique d'analyse largement reconnue permet de mesurer la capacité thermique molaire d'échantillons en fonction de la température. Elle s'est avérée particulièrement utile pour évaluer la stabilité thermique des biomolécules, notamment des protéines.
• Dichroïsme circulaire (CD): cette technique permet d'évaluer rapidement la structure secondaire, les caractéristiques de repliement et les propriétés de liaison des protéines. Le dichroïsme circulaire repose essentiellement sur l'absorption différentielle de la lumière polarisée circulairement à gauche et à droite. En outre, le dichroïsme circulaire peut être utilisé pour étudier les interactions protéiques et évaluer la dénaturation thermique des protéines et la liaison des ligands. Cependant, ces applications sont considérées comme des méthodes à faible débit, ce qui signifie qu'elles peuvent ne pas convenir à des études à grande échelle ou à haut volume.^4,5
• Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR): Cette technique non invasive d'analyse de la structure des protéines utilise des énergies photoniques minimales afin d'éviter les réactions indésirables. Elle évite le chauffage des échantillons, ne nécessite que de petites quantités d'échantillons et ne requiert pas une grande pureté. Sa résolution temporelle intrinsèque est de quelques picosecondes. Cependant, elle manque de sélectivité des liaisons, ce qui entraîne un chevauchement des contributions des protéines.⁶
• Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN): Il s'agit d'une méthode non destructive permettant d'étudier la structure des molécules au niveau atomique, offrant ainsi un aperçu de la dynamique et des interactions moléculaires. Elle présente toutefois certaines limites. Parmi celles-ci, on peut citer une faible sensibilité aux concentrations insuffisantes des échantillons, qui se traduit par des spectres de mauvaise qualité, des coûts élevés liés aux instruments et à leur maintenance en raison de la nécessité d'utiliser des aimants puissants et des liquides de refroidissement, et la difficulté d'analyser les molécules de poids moléculaire élevé en raison de la complexité de l'interprétation des spectres.⁷

Agrégation des produits biologiques

• Chromatographie d'exclusion stérique avec diffusion de lumière multi-angle (SEC-MALS): méthode biophysique précise et adaptable pour la caractérisation des protéines et des agrégats, cette méthode permet de déterminer la composition, la masse et l'état oligomérique des protéines membranaires dans des solutions détergentes.
• Ultracentrifugation analytique (AUC): Il s'agit d'une technique très efficace pour détecter les agrégats et sensible à la forme moléculaire des protéines. Elle est souvent utilisée pour déterminer l'état d'oligomérisation des protéines, estimer les constantes de dissociation et évaluer l'impact des tampons sur la solubilité des protéines. Malgré son utilisation répandue et la précision de ses résultats, l'AUC est un processus qui prend beaucoup de temps. Elle est donc souvent utilisée pour confirmer les données obtenues à partir de méthodes de criblage à haut débit plutôt que comme méthode d'analyse principale.⁸
• Diffusion dynamique de la lumière (DLS): cette méthode est utilisée pour analyser le profil de distribution granulométrique de minuscules particules en suspension ou de polymères en solution, y compris les agrégats protéiques. Elle peut être appliquée aux protéines membranaires et permet une analyse à haut débit. Cependant, l'interprétation des données peut s'avérer difficile lorsque les échantillons sont polydispersés ou contiennent des agrégats plus gros. Une pratique courante pour améliorer la qualité des données consiste à filtrer les échantillons avant de les tester.⁹
• Microscopie à membrane: cette technique permet de réduire le temps et le volume d'échantillon nécessaires pour réaliser des tests adéquats. Par exemple, l'obscurcissement de la lumière (LO) — qui consiste à faire passer un flux de particules entre une source lumineuse et un détecteur — est un protocole courant qui a été adapté par l'industrie biopharmaceutique à partir du secteur aéronautique (qui l'utilisait pour l'analyse du carburant) afin de différencier les particules dans les médicaments. Cependant, en raison du volume élevé requis, il n'est pas possible d'observer les particules aux premiers stades de leur développement avec la LO. De plus, les produits biologiques sont pratiquement invisibles dans un liquide lorsqu'ils sont imagés, car ils ont le même indice de réfraction que le milieu dans lequel ils se trouvent. En outre, la LO ne permet pas d'identifier les particules individuellement, ce qui laisse les développeurs de médicaments perplexes quant à l'origine des particules ou les conduit à caractériser de manière inexacte les thérapies médicamenteuses.⁹

Une menace cachée pour le développement de médicaments nécessitant la caractérisation biophysique des protéines et leur agrégation 

L'agrégation des protéines est un attribut de qualité critique (CQA) qui peut avoir des répercussions importantes sur l'efficacité et la sécurité des produits biothérapeutiques. L'évaluation, la formulation, la surveillance et l'atténuation de l'agrégation des protéines nécessitent une analyse approfondie de divers paramètres, tels que la taille, le nombre, la morphologie, la forme et l'identification. Ces méthodes biophysiques de caractérisation des protéines peuvent être complexes, longues et coûteuses en ressources, et nécessitent une expertise et des équipements spécialisés. 

Heureusement, avec Aura®’s capacités d'analyse avancées, optimisées par Imagerie par membrane en arrière-plan (BMI) et technologie de microscopie par membrane à fluorescence (FMM) Il est possible d'obtenir des données d'analyse des particules claires et rapides. 

La FMM est une méthode innovante d'identification des particules qui utilise la BMI pour détecter et classer les particules les plus courantes dans les échantillons de bioformulations. Cette technique avancée de caractérisation biophysique exploite le BMI, qui capture des images d'une plaque à membrane à 96 puits avant et après la filtration de l'échantillon, en utilisant une analyse d'images à contraste optique élevé pour distinguer les particules dont la taille varie de 1 μm à 5 mm, avec une plage dynamique de plus de 36/mL. La FMM utilise ensuite des colorants fluorescents extrinsèques établis pour analyser les particules et confirmer leur présence. En colorant les particules et en extrayant des informations essentielles sur leur nombre, leur morphologie, leur taille et leur intensité de diffusion de la lumière à partir du masque de particules généré par le logiciel, la FMM offre une méthode inestimable pour examiner des échantillons biologiques complexes. 

Conclusion

Historiquement, les méthodes biophysiques traditionnelles utilisées pour caractériser les protéines exigeaient beaucoup de temps et de volumes d'échantillons importants, et ne pouvaient être utilisées qu'aux étapes finales du développement, ce qui est déjà trop tard si un médicament s'avère inefficace ou potentiellement nocif. Cependant, des plateformes innovantes telles qu'Aura, qui exploitent des techniques telles que les formes contemporaines de microscopie membranaire, réduisent le temps et les volumes d'échantillons nécessaires pour effectuer des tests adéquats.

Cette technologie facilite la prise de décision lors de la découverte tardive et tout au long du développement, étapes du processus où la technologie conventionnelle d'analyse des particules est trop lourde et consomme trop d'échantillons pour être utilisée. 

Références

1. Solomon, T.L., Delaglio, F., Giddens, J.P., Marino, J.P., Yu, Y.B., Taraban, M.B., Brinson, R.G. « Évaluation analytique et fonctionnelle corrélée des perturbations de structure d'ordre supérieur résultant de l'oxydation du NISTmAb ». MAbs, vol. 15, n° 1, 2023, pp. 2160227. PMC9872951. doi:10.1080/19420862.2022.2160227 
2. Vedadi, M., Arrowsmith, C.H., Allali-Hassani, A., Senisterra, G., Wasney, G.A. « Caractérisation biophysique des protéines recombinantes : la clé d'une génomique structurale plus performante ». J Struct Biol, vol. 172, n° 1, 2010, pp. 107-19. PMC2954336. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005 
3. Kwan, T.O.C., Reis, R., Siligardi, G., Hussain, R., Cheruvara, H., Moraes, I. « Sélection de méthodes biophysiques pour la caractérisation des protéines membranaires ». Int J Mol Sci, vol. 20, n° 10, 2019, p. 2605. PMC6566885. doi:10.3390/ijms20102605 
4. Durowoju, I.B., Bhandal, K.S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. « Calorimétrie différentielle à balayage – Une méthode pour évaluer la stabilité thermique et la conformation des antigènes protéiques ». J Vis Exp, n° 121, 2017, p. 55262. PMC5409303. doi:10.3791/55262 
5. Vedadi, M., Arrowsmith, C.H., Allali-Hassani, A., Senisterra, G., Wasney, G.A. « Caractérisation biophysique des protéines recombinantes : la clé d'une génomique structurale plus performante ». J Struct Biol, vol. 172, n° 1, 2010, pp. 107-19. PMC2954336. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005 
6. « News Medical ». Le rôle de la FTIR dans l'analyse des protéines et les applications biomédicales, 18 juillet 2022,https://www.news-medical.net/news/20220718/The-role-of-FTIR-in-protein-analysis-and-biomedical-applications.aspx 
7. Kaveti, Bhavna. « Quels sont les avantages et les limites de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ? » AZoOptics, 18 octobre 2023,https://www.azooptics.com/Article.aspx?ArticleID=2460 
8. Kwan, T. O. C., Reis, R., Siligardi, G., Hussain, R., Cheruvara, H., & Moraes, I. « Sélection de méthodes biophysiques pour la caractérisation des protéines membranaires ». Int J Mol Sci, vol. 20, n° 10, 2019, p. 2605. PMC6566885. doi:10.3390/ijms20102605 
9. « La microscopie membranaire contribue à garantir la sécurité des médicaments pour les patients. » Photonics.https://www.photonics.com/Articles/Membrane_microscopy_is_helping_to_ensure_that/a68087