探索细胞成像技术——类型、分析与应用

理解健康细胞与病变细胞的迁移、形态及生理变化等细胞功能，对于把握生物学过程并优化生物治疗药物的研发至关重要。活细胞成像技术能即时呈现细胞、组织或生物体的当前状态，其逼真程度近乎体内环境，且避免了固定细胞样本中常见的人为干扰。  

细胞成像是一种非侵入性方法，可追踪癌症及其他疾病中与健康相关的属性及与疾病相关的异常。该技术能揭示疾病的病因、进展及最终结局等重要信息。成像技术可自动量化细胞特性，并描绘细胞在疾病进程、生长及基因改造过程中可能发生的表型变化。 活体成像对理解细胞功能和过程至关重要，因为它能够精确且通常实时地重建细胞事件。这比仅提供单一时间点、无法呈现细胞完整过程的固定细胞观察更为先进。然而，活细胞成像技术必须实现100%的穿透性。遗漏任何步骤或过程都可能导致忽视健康或病变细胞中的关键事件。 

细胞成像技术类型 

光学显微镜 

• 明场显微镜——作为最传统（也是最古老）的显微镜形式，该技术在进行无标记细胞检测时仍具有重要价值，可用于观察细胞数量、增殖、健康状况、汇合度及细胞毒性。  该技术通过光吸收、折射率或颜色的变化产生对比度，始终是备受青睐的光学显微技术。当光线穿过细胞（或组织、生物体）时，改变光波方向、速度或光谱的区域会在光线聚合聚焦时形成对比。 
• 相差显微镜——该技术将微小的相位变化转化为对应的光幅变化，进而通过图像对比度差异呈现。配备同心环的专用聚光镜与后焦平面含环状结构的物镜组相匹配。此技术可增强培养活细胞成像时的对比度，但也会在边缘轮廓产生过度晕圈，导致边界细节辨识度降低。  
• 差分干涉对比（DIC）显微镜——该技术通过平面偏振光与光切棱镜，放大样本厚度及其折射率的细微差异。由于细胞内水相与脂质部分存在折射率差异，此技术能更清晰地呈现细胞脂质双层结构。  

荧光显微镜 

• 基础荧光显微镜——该技术仍需借助光学显微镜，但通过荧光而非散射或反射光来观察细胞结构与功能。此技术利用短波长光激发荧光团，使其发出长波长光，该光线随后被显微镜检测到。  
• FMM/BMI/SIMI —  作为 Aura system of analyzers, 该技术融合了现有光学显微镜与荧光显微镜的优势。  背景膜成像（BMI）是一种高对比度成像技术，通过使用高对比度膜清晰呈现样本中的颗粒图像。该技术仅需5微升样本，一分钟即可得出结果。荧光膜显微镜（FMM）利用特定荧光染料或抗体标记颗粒，实现简单而明确的识别。 侧向照明膜成像（SIMI）技术与BMI及FMM协同工作，通过检测光散射现象识别高折射率颗粒——包括从膜表面突出的颗粒。SIMI检测到的散射光颗粒表明存在玻璃或塑料等无机物突起，而吸收光的颗粒则提示存在金属颗粒（如残留的Dynabeads）。^颞部以及吸收同样从膜中突出的油脂。 

• 共聚焦显微镜——一种荧光显微技术，通过特定光学元件对荧光探针标记的样本生成高分辨率图像。该方法能够生成清晰的三维图像，其成像原理是利用空间光阑阻挡离焦光线。 
• 双光子显微镜——也称为2PEF或TPEF，这种显微镜与标准荧光显微镜略有不同，因为它基于两个波长比发射光更长的光子同时激发。激光聚焦于组织中的特定位置，并扫描样本以依次生成图像。该技术适用于厚度不超过1毫米的组织。 

高级技术

• 超分辨率技术（STED、PALM、STORM）——该技术可生成远高于光学显微镜的图像分辨率（光学显微镜分辨率约为200纳米）。受激辐射淬灭（STED）、随机光学重构显微镜（STORM）和光激活定位显微镜（PALM）能提供约20倍于光学显微镜的分辨率。  
• 全内反射荧光（TIRM）——该方法通过利用介质界面附近振荡波场散射的光来追踪和检测物体。其具有高信噪比和高垂直空间分辨率。 
• 电子显微镜——这类显微镜利用电子束而非光子束聚焦成像。相较于光学显微镜，其成像分辨率更高且放大倍率更大。  
• 透射电子显微镜（TEM）——用于成像物质中最微小的结构，该技术利用电子束穿透样品，从而揭示组织、细胞或其他材料的内部构造与成分。  
• 扫描电子显微镜（SEM）——与其他电子显微镜技术类似，SEM同样利用电子束成像，但其主要观察样品的表面形态与成分组成，而非内部结构。  

其他成像技术

• 原子力显微镜（AFM）——该技术能在生物材料的天然环境中生成其表面的纳米级图像。通过该技术，机械探针利用电动力在电子指令下产生微小但精确的运动，从而实现精密扫描。 
• 高内涵筛选——该技术涵盖多种检测方法，通常采用荧光染料实现细胞可视化，从而确定细胞内的功能与运作机制。高内涵显微技术已超越传统显微镜的分辨能力，并整合自动化成像与分析功能，适用于大规模细胞研究。

细胞成像数据分析

图像处理——有多种技术可用于提升图像质量与清晰度。此外，科研机构已制定清单规范，确保发表高质量、清晰的显微图像。首先，看似显而易见的一步是：确保显微镜（聚光镜与物镜）对准无误，并采用正确的孔径设置（适用于光学显微镜）。针对其他方法（如荧光显微镜）亦存在相应规范指南。 

欧洲分子生物学实验室（EMBL）数据科学中心团队负责人克里斯蒂安·蒂舍强调：“对于显微镜研究，这涉及诸多方面——从出版物图示中图像数据的可读性、提供尺度信息、负责任地调整对比度，到在公共档案库共享图像数据，以及在云计算平台上开放分析流程。” 

The Aura system of particle analyzers 结合明场（即明场）和荧光技术，以创建具有更高灵敏度和更高分辨率图像的检测方法。该系统还包括 粒子Vue分析程序 有助于改善图像并提供定量、可操作的数据。  

定量分析——若无法从图像中提取定量数据，图像便失去重要价值。多种工具可用于统计样本中的细胞与颗粒数量，通过活/死细胞检测评估细胞毒性，测量自噬作用，确定细胞表型（如细胞形态、大小和结构），定位细胞内特定分子，并分析随时间变化的动态过程。  

数据解读

形态学分析 — 确定细胞及其他颗粒和组分的大小、形状和结构，有助于评估候选治疗方案的有效性，并揭示疾病引发的改变。 The Aura family of analyzers 和 粒子Vue分析软件 能够精确判定健康细胞与病变细胞的形态及变化，以及药物治疗引发的反应。区分活细胞与非活细胞的常用方法是使用DAPI染色细胞，并通过Aura平台的FMM技术分析细胞状态群体分布。 

分子定位——精确定位细胞内特定分子的位置，有助于确定它们在健康、疾病及治疗反应中的作用。 这些技术（如单粒子追踪法（SPT）和单分子定位显微镜法（SMLM））能够在纳米尺度上识别分子，并确定细胞内蛋白质及其他重要分子的位置与运动轨迹。  

延时成像——通过监测细胞在特定时间段内的反应，可帮助确定读取终点检测结果的最佳时机，同时表征多种反应的细胞动力学特性，并追踪治疗对细胞产生的实时影响。自动化延时成像技术还能显著缩短分析时间。  

高级分析技术

三维重建——这些技术利用成像数据构建细胞及细胞组分的立体模型。三维细胞培养（或自动化构建）相较于传统单层（二维）技术，能提供更贴近生理状态的实验环境。  

荧光寿命成像（FLIM）——这项先进技术能够同时记录荧光分子在图像中的荧光寿命和空间位置。FLIM可帮助研究人员探究活细胞内的pH值、离子浓度、溶剂极性、非共价相互作用、粘度及氧分压。  

细胞成像技术的应用

细胞生物学研究 

研究细胞结构与功能——细胞器和膜的结构是理解细胞发育机制以及遗传、生理和发育过程的关键。这不仅有助于基础层面理解细胞运作原理，更能揭示细胞在病态状态下的行为模式。 成像技术同样有助于解析这些细胞结构的功能。延时细胞成像可直观呈现这些结构在发育、健康、疾病及死亡过程中经历的（或激活的）变化。  

追踪细胞动态——成像技术助力研究人员实时观察细胞迁移、分裂与分化过程。细胞活动涵盖多种时空尺度，包括发育过程与癌症转移。不同技术可揭示这些过程的运作机制，实现实时监测、三维成像或细胞/亚细胞膜层面的解析。  

医学研究 

疾病机制——细胞成像技术能更清晰地揭示疾病如何在细胞内形成、如何（在某些情况下）接管细胞功能，以及最终如何损伤或杀死细胞。三维显微镜技术正被用于观察阿尔茨海默病或帕金森病期间神经细胞的变化，而超分辨率显微镜则用于在免疫反应过程中可视化并量化血小板膜蛋白。 其他荧光技术正被用于可视化CAR-T细胞疗法的作用机制，并深化对受控细胞死亡的理解。  

药物发现与开发——获取药物候选分子作用下细胞结构与功能的精准详实图像，是研发新型疾病疗法和疫苗的关键环节。诸如Aura粒子分析系统等技术可运用FMM和BMI方法，结合光学显微与荧光显微技术，解析细胞对药物候选分子的响应机制，并识别可能干扰该响应的其他分子与结构因素。  

基因研究 

基因表达研究——结合新一代测序等先进遗传学技术，显微镜技术可识别基因型变化引发的表型改变。电子显微镜能定位特定蛋白质及其他分子变化，而光学与荧光显微技术则能呈现细胞结构与功能在遗传变异作用下的动态图像。活细胞成像技术的进步使我们能够实时观察基因表达及细胞内相互作用。 

CRISPR与基因工程——CRISPR-Cas9作为一种强大且多功能的基因编辑工具，亦可用于在活细胞中可视化DNA复制与突变过程。经荧光蛋白标记的Cas9蛋白能标记靶向位点，并通过显微镜实现可视化观察。 其他科学家正探索CRISPR如何构建基因组三维图像及完整染色体结构图谱。同样，分子成像技术在监测细胞移植状态及其与局部微环境、细胞替代和/或基因替代的关系方面，使细胞成像成为评估基因工程技术效果的极具前景的方法。  

总结

尽管成像技术在过去几十年间取得了巨大进步，但以高分辨率观察细胞及亚细胞过程的同时保持环境背景仍面临挑战，尤其是在微创操作方面。细胞分辨率技术——特别是涉及环境背景和活体生物的研究——仍需进一步发展（目前有多个实验项目正在进行）。 观察细胞内蛋白质——包括其结构、数量、细胞内定位及活性——虽可通过电子显微镜实现，但亟需能实时观测且能识别更小分子的技术。数据采集与分析需要更通用的标准，而全球范围内对这些技术的更广泛获取将极大推动科学研究的发展。  

参考文献

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01987-9

https://www.nature.com/articles/s41592-021-01156-w?fromPaywallRec=false

https://www.nature.com/articles/d42473-022-00356-y

^Dynabeads™是赛默飞世尔科技公司的注册商标。