生物物理表征方法学

沃特工作人员

,
阅读时间：7分钟
生物物理表征

蛋白质的生物物理特性表征是蛋白质治疗药物生产与开发过程中不可或缺的环节，它能帮助全面理解蛋白质的功能与结构。通过分析和定义潜在药物靶标的高级结构，这一过程有助于识别并缓解可能显著影响产品疗效和安全性的问题，例如稳定性差和聚集现象。1,2

蛋白质的生物物理特性表征

此外，生物物理表征是药物早期研发阶段的关键工具，有助于识别和评估潜在药物靶点及其与治疗化合物的相互作用。通过深入解析蛋白质治疗剂的结构动力学特性，生物物理表征在优化药物设计流程中发挥着核心作用，确保在开发可能挽救生命的治疗方案时兼顾安全性和有效性。3

常见生物物理表征技术

在蛋白质表征的生物物理方法领域，研究人员拥有多种选择来分析分子的二级和三级结构，以及聚集现象。 

二级结构与三级结构

  • 差示扫描量热法（DSC）：这项广受认可的分析技术可测量样品随温度变化的摩尔热容。该方法在评估生物分子（包括蛋白质）的热稳定性方面已被证明具有特别显著的实用价值。
  • 圆二色性（CD）：该技术可快速评估蛋白质的二级结构、折叠特性及结合性质。其原理在于左旋与右旋圆偏振光的吸收差异。 此外，圆二色性技术还可用于研究蛋白质相互作用，评估蛋白质热变性及配体结合。但这些应用被视为低通量方法，表明其可能不适用于大规模或高通量研究。⁴,⁵
  • 傅里叶变换红外（FTIR）光谱法：这种用于蛋白质结构分析的无创技术采用极低的光子能量，以避免引发非预期反应。该方法无需加热样品，仅需微量样本，且对样品纯度要求不高。其固有时间分辨率可达数皮秒。然而，该技术缺乏键选择性，导致不同蛋白质的信号产生重叠。⁶
  • 核磁共振（NMR）光谱学：这是一种在原子层面上研究分子结构的无损方法，能深入揭示分子动力学与相互作用机制。 然而该技术存在局限性：对样品浓度要求高导致灵敏度低，易产生劣质谱图；因需强力磁体和冷却液，仪器及维护成本高昂；且高分子量物质的谱图解读复杂，分析难度较大。

生物制品聚合

  • 尺寸排阻色谱-多角度光散射法（SEC-MALS）：作为一种精确且适应性强的生物物理方法，可用于蛋白质表征及聚集物分析，该技术能够在洗涤剂溶液中测定膜蛋白的组成、质量及寡聚状态。
  • 分析性超速离心法（AUC）：该技术在检测蛋白质聚集物方面效果显著，且对蛋白质分子构象具有高敏感性。 该技术常用于确定蛋白质的寡聚化状态、估算解离常数，并评估缓冲液对蛋白质溶解度的影响。尽管应用广泛且结果精确，AUC仍属耗时过程。因此，它通常作为高通量筛选方法数据的验证手段，而非主要分析方法。
  • 动态光散射（DLS）：该方法用于分析悬浮液中微小颗粒或溶液中聚合物的粒径分布曲线，包括蛋白质聚集物。它可应用于膜蛋白，并具备高通量分析能力。 然而当样品呈多分散性或含有较大聚集体时，数据解读可能变得困难。为提升数据质量，常见做法是在测试前对样品进行过滤。 9
  • 膜显微技术：该技术可缩短充分检测所需的时间并降低样本体积要求。例如，光遮蔽法（LO）——即让粒子流通过光源与探测器之间——是生物制药行业从航空领域（用于燃料分析）借鉴而来的一种常见检测方案，用于区分药物中的不同粒子。 然而，由于其对样本体积要求较高，LO技术无法在研发早期阶段观察颗粒。此外，生物制剂在液体中成像时几乎不可见，因为生物制剂与其所处的培养基具有相同的折射率。更重要的是，LO技术无法实现单个颗粒的识别，这使得药物开发者要么困惑于颗粒来源，要么对药物疗效进行不准确的表征。9

药物研发中隐匿的威胁：蛋白质与聚集现象的生物物理表征需求 

蛋白质聚集是影响生物治疗药物疗效和安全性的关键质量属性（CQA）。 评估、制剂开发、监测及缓解蛋白质聚集需要对多种参数进行深入分析，包括尺寸、数量、形态、形状及鉴定。这些用于蛋白质表征的生物物理方法往往复杂、耗时且资源密集，需要专业知识和专用设备。 

幸运的是，随着 Aura®’s 先进的分析能力，由...提供支持 背景膜成像（BMI）与荧光膜显微镜（FMM）技术， 清晰且快速的粒子分析数据得以实现。 

FMM是一种创新的颗粒识别方法，利用BMI技术检测并分类生物制剂样本中最常见的颗粒。 这项先进的生物物理表征技术依托BMI系统，通过对96孔膜板在样品过滤前后进行成像，运用高光学对比度图像分析技术，可识别尺寸范围从1微米至5毫米的颗粒，动态范围超过36/mL计数值。 FMM继而运用成熟的外源性荧光染料化学体系分析颗粒并确认其存在。通过染色标记颗粒，并从软件生成的颗粒遮罩中提取关键信息（包括计数、形态、尺寸及光散射强度），FMM为复杂生物样本的精细化检测提供了不可或缺的解决方案。 

明场粒子掩模与荧光膜显微镜
图1. 颗粒掩膜与FMM分析：（a）明场颗粒掩膜表征了颗粒的整体分布（尺寸与计数）。黑色区域表示未测得颗粒；白色区域表示BMI中测得的颗粒。（b）在蛋白质/非蛋白质混合物中对蛋白质颗粒进行荧光标记后进行的FMM分析。 

总结

传统上，用于蛋白质表征的生物物理方法需要耗费大量时间和样本量，且仅能在研发的最终阶段使用——若此时发现药物无效或存在潜在危害，则为时已晚。然而，像Aura这样的创新平台通过运用现代膜显微镜技术等手段，正在缩短充分测试所需的时间和样本量要求。

这项技术正在推动后期发现阶段及整个开发过程中的决策制定，在这些环节中，传统颗粒分析仪技术因操作繁琐且耗样过多而难以应用。 

参考文献

  1. 所罗门, T.L., 德拉吉奥, F., 吉登斯, J.P., 马里诺, J.P., 于, Y.B., 塔拉班, M.B., 布林森, R.G. "NISTmAb氧化产生的高阶结构扰动相关分析与功能评估." MAbs，第15卷，第1期，2023年，第2160-227页。PMC9872951。doi:10.1080/19420862.2022.2160227 
  2. Vedadi, M., Arrowsmith, C.H., Allali-Hassani, A., Senisterra, G., Wasney, G.A. "重组蛋白的生物物理表征：提升结构基因组学成功率的关键。"《结构生物学杂志》第172卷第1期，2010年，第107-119页。 PMC2954336. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005 
  3. 关，T.O.C.；雷斯，R.；西利加迪，G.；侯赛因，R.；切鲁瓦拉，H.；莫拉埃斯，I. "膜蛋白表征的生物物理方法选择." 《国际分子科学杂志》，第20卷，第10期，2019年，第2605页。 PMC6566885. doi:10.3390/ijms20102605 
  4. 杜罗沃伊，I.B.；班达尔，K.S.；胡，J.；卡皮克，B.；基尔基塔泽，M.《差示扫描量热法——评估蛋白质抗原热稳定性与构象的方法》。《实验视频期刊》，第121期，2017年，第55262页。 PMC5409303. doi:10.3791/55262 
  5. Vedadi, M., Arrowsmith, C.H., Allali-Hassani, A., Senisterra, G., Wasney, G.A. "重组蛋白的生物物理表征：提升结构基因组学成功率的关键。"《结构生物学杂志》第172卷第1期，2010年，第107-119页。 PMC2954336. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005 
  6. 《医学新闻》。傅里叶变换红外光谱在蛋白质分析与生物医学应用中的作用，2022年7月18日，https://www.news-medical.net/news/20220718/The-role-of-FTIR-in-protein-analysis-and-biomedical-applications.aspx 
  7. 卡维蒂，巴夫娜。《核磁共振光谱法的优势与局限性何在？》AZoOptics，2023年10月18日，https://www.azooptics.com/Article.aspx?ArticleID=2460 
  8. 关天奥、雷斯、西利加迪、侯赛因、切鲁瓦拉、莫拉埃斯。《膜蛋白表征的生物物理方法选择》。《国际分子科学杂志》，第20卷，第10期，2019年，第2605页。 PMC6566885. doi:10.3390/ijms20102605 
  9. “膜显微技术助力确保药物对患者的安全性。”《光子学》。https://www.photonics.com/Articles/Membrane_microscopy_is_helping_to_ensure_that/a68087