色谱柱也很重要：如何通过考虑分离本身来改进纳米和微流LC-MS蛋白质组学研究

马库斯-万宁格

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第1部分：捕集和洗脱配置如何解决蛋白质组纳米流和微流LC-MS的许多问题

在与积极使用纳米级和微流LC-MS系统的科学家的讨论中（例如，在蛋白质组学和肽图中），我发现一个有趣的现象，即大量的精力都花在了系统设置上，例如流体连接或MS数据收集参数。

虽然这些显然很重要，但令我惊讶的是，相对而言，很少有人花时间考虑选择捕集和分析柱的固定相。 这是一个多肽--所以你将只使用C18柱，对吗？并非如此。

在我的三部曲中，让我们探讨一下固定相的最佳配对如何能大大改善你的纳流和微流LC-MS结果。

在考虑纳米和微型色谱柱的选择时，有两个方面往往被忽视了。

  • 诱捕和不同的诱捕配置，它们都有一个特定的目的，帮助科学家达到优化分离和样品产量的目标。
  • 为捕集柱和分析柱选择固定相和固定相的组合，以及这对分析结果的影响，从分辨率、峰宽、峰容量到基本上确定的肽或其他感兴趣的物种的数量。

让我们仔细看看诱捕的基础知识，以及在LC分离中实施诱捕步骤的优势和注意事项。

我们知道，纳米和微流LC-MS至少在两个重要方面利用了色谱和LC-MS界面的小型化。小的样品量和高效的电离和质谱采样，以及经常减少的基质效应，都对LC-MS检测的信噪比或灵敏度有积极影响。

纳米和微流LC-MS的体积问题

然而，纳米LC检测的灵敏度的提高很容易被不良的实验方法所影响。柱子体积的减少使得纳米和微流液相色谱更容易受到色谱条件的不相容性的影响，而这些条件可能对更大规模的分析柱没有影响。

举例来说，用于纳米LC的75微米内径（I.D.）的柱子比相同长度的2.1毫米I.D.分析柱的体积小780倍。例如，在75微米内径的柱子上直接注入5微米的样品，就相当于在2.1毫米内径的柱子上注入3.9毫升的样品一样。而这很可能会变成一个色谱混乱。

在这样的注射量下，颗粒或其他有问题的物种，如残留的蛋白质或脂类，在几次注射中就会显示出它们的麻烦性。纳米LC柱的进样口可能会被堵塞，或者柱子的填料可能会被弄脏而失去其保留能力。此外，在这些注射量下，任何上游（在线或离线）样品制备步骤的溶剂强度也可能破坏色谱分离。

而且我还没有提到将样品装入分析柱的难以置信的漫长时间。在典型的300纳升/分钟的流速下，仅仅冲洗5微升的体积就需要大约17分钟。如果样品回路更大，所需时间会更长。

诱捕柱

这就是捕集和洗脱配置解决了蛋白质组学纳米和微流LC-MS的许多问题。在这种设置下，样品首先被注入并集中到捕集柱上。捕获柱的设计是通过使用比相应分析柱更大的内径硬件和更大的颗粒，使这一步骤在相对较短的时间内以高流速发生。

捕获器过滤掉样品中的杂质或不需要的物质，同时保留感兴趣的分析物。在随后的步骤中，被捕获的相关分析物在流动相中被重组，并以较低的流速洗脱到分析柱上进行分析分离。

诱捕的优势。

  • 提高了样品的装载速度
  • 增加体积负荷，从而提高柱子上的质量负荷，导致纳米LC-MS检测的动态范围增加
  • 在注射到分析柱之前进行额外的样品净化

从本质上讲，捕集柱是一个等待和清洗的区域，在各组分被洗脱并在下游分析柱上进一步高分辨率分离之前，对注入的样品进行清洗。

当然，使用捕集-洗脱法需要一些方法的开发。虽然优化好的捕集方法可以实现上述所有的好处，但设计不好的捕集方法不仅会导致MS信号强度的损失，还会导致分析物的损失。

诱捕和删除系统的配置

捕集器洗脱的两个主要系统配置是正向捕集-洗脱，这是最基本的设置，或者是更复杂的反向捕集-洗脱设置。这些设置都有各自的优势和劣势。

在正向捕集-稀释配置中，样品只是从进样阀装到捕集柱上，进行清洗，然后通过捕集柱的出口推到分析柱上。疏水阀的阀门使水流在疏水阀的装载和清洗步骤中不会到达分析柱。这个流路将被关闭，在洗脱步骤中，水流被强制推到分析柱上。

在反向捕集-洗脱配置中，样品也将以正常的流动方向被加载到捕集柱上。然而，在完成装载和清洗步骤后，通过切换捕集阀使流动方向相反。样品被反向洗脱，通过捕集柱的入口进入分析柱。一个辅助泵确保分析柱始终看到流动相的流动，即使是在装载步骤中。

样品装载和洗脱

在深入讨论捕集和洗脱样品之前，我只想提醒读者关于van Deemter曲线及其对色谱的意义--它主要说明，如果一个色谱带以非最佳线速度沿填料床迁移，该色谱带会出现严重的拓宽。这种效应对于较大的颗粒，例如用于捕集柱的颗粒，以及用于分析用纳米和微流柱的较小的颗粒来说，更加明显。有兴趣的人可以阅读这篇精彩的文章 about band broadening in chromatography.

在这两种捕集的情况下，加载步骤都是在高流速下进行的，并通过捕集柱的入口。理想情况下，注入的分析物带被保留下来，因此在一定程度上集中在捕集柱的入口处。当然，分析物被集中的程度以及它们所占的柱体积取决于分析物的疏水性。

在洗脱时，降低流速以使纳米柱中的分析分离效率最大化--通常是以适合纳米柱小孔的非常低的流速。如果分析物在正向被洗脱（与装填流的方向相同），样品必须以不太理想的速度沿捕集器填料床的整个长度迁移（别忘了捕集器的硬件和颗粒要比纳米柱的大得多）--这就会造成明显的带宽。

当捕集器以逆流方向洗脱时，分析物带只需沿填料床迁移一小段距离--带宽效应将明显减少。这种带状增宽的减少是反向捕集-洗脱方法的一个重要好处。有一种方法可以在一定程度上恢复带状增宽的效果。该方法并不总是可行的，但如果使用得当，可以很强大。

这总是取决于你的样品和它的基质...

在这篇文章中，我谈到了两种最常见的捕集-洗脱系统配置，并指出了对色谱分离质量的潜在影响，这取决于是使用较简单的正向捕集-洗脱法还是较复杂的反向捕集-洗脱法。当然，正确的答案是不确定的，而且会因样品的性质和样品基质的不同而有很大的差异。然而，我相信在评估你的纳米或微流分离时，应该考虑上述想法。因为归根结底，在选择一种方法时，我们可能都最关心鉴定的蛋白质和肽的数量或定量的准确性。

在下一篇文章中，我将讨论固定相的影响，以及如何选择最佳的固定相，用于多肽分析的捕集和稀释纳米和微流LC-MS。

 

额外资源

我的同事Patty Sun写了两篇关于提高采样效率和矩阵效应的精彩文章。我推荐大家阅读这两篇文章，以便对这些主题有更深入的思考。