¿Qué ocurre realmente en el interior de la cápside de las partículas virales similares (VLP) del norovirus?

Kate Yu

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virus adenoasociado (AAV), ilustración en 3D, fondo azul. Una representación en 3D muy detallada y realista del virus adenoasociado (AAV), en la que se aprecia su intrincada estructura de cápside.

Las partículas similares al virus (VLP) del norovirus son estructuralmente heterogéneas y están formadas por una única proteína de cápside que se autoensambla en múltiples geometrías, lo que dificulta enormemente su caracterización completa mediante espectrometría de masas (MS) convencional.

Un artículo reciente publicado en bioRxiv por la Dra. Charlotte Uetrecht y sus colegas del Centro de Biología Estructural de Sistemas (CSSB) de Hamburgo (Alemania), en colaboración con científicos de Waters, demuestra cómo la espectrometría de masas con detección de carga (CDMS) resulta fundamental para descubrir un proceso de ensamblaje no clásico de la cápside, invisible para cualquier otro método.

En el estudio se utilizó el método CDMS para analizar dos cepas de norovirus humano, y se recurrió a la criomicroscopía electrónica y a la proteómica «bottom-up» para obtener una validación ortogonal. 

El problema fundamental: la heterogeneidad frustra la espectrometría de masas convencional

Las VLP del norovirus pueden adoptar geometrías T=1, T=3, T=4 y otras. Esto, junto con el procesamiento del extremo N-terminal de la proteína de la cápside VP1, da lugar a distribuciones de masa superpuestas que la espectrometría de masas nativa convencional no puede resolver; las poblaciones de partículas coexistentes, incluidas las especies no icosaédricas, quedan totalmente ocultas.

Cómo resuelve el problema el CDMS

El CDMS determinó simultáneamente la masa y la carga de cada uno de los iones, sin necesidad de resolver el estado de carga. Los autores compararon los resultados obtenidos con el Xevo CDMS, basado en la tecnología ELIT (Electrostatic Linear Ion Trip), y con la tecnología DMT (Direct Mass Technology), basada en Orbitrap, y señalaron que:

  • Ambas plataformas identificaron los mismos ensamblajes principales en las VLP de GI.1 Norwalk y GII.17 Kawasaki.
  • El sistema Waters Xevo CDMS proporcionó masas más cercanas a los valores teóricos, lo que se atribuye a su doble calibración de m/z y carga, que tiene en cuenta la masa del aducto.
  • La técnica DMT, combinada con la deconvolución UniDec (UCD), permitió alcanzar una mayor resolución de masa aparente, a costa de una mayor complejidad del flujo de trabajo y un mayor riesgo de que se produjeran artefactos de deconvolución.

El CDMS y la criomicroscopía electrónica revelan conjuntamente una nueva cápside GII.17

La combinación de CDMS y criomicroscopía electrónica permitió el descubrimiento y la validación estructural de un nuevo estado de ensamblaje viral que habría sido difícil de identificar con cualquiera de las dos técnicas por separado.

  • El CDMS detectó tres poblaciones distintas de cápsides en el virus Kawasaki GII.17: la clásica T=3 (~10,65 MDa), la T=4 (~14,25 MDa) y una especie intermedia inesperada (~12,58 MDa).
  • El análisis de masa estimó unas 212 subunidades VP1 para la partícula intermedia, lo que sugiere un ensamblaje no icosaédrico incompatible con la simetría tradicional de Caspar-Klug.
  • La crio-microscopía electrónica confirmó la identidad estructural de esta especie como una cápside prolata (de forma ovalada) y proporcionó las primeras imágenes de los ensamblajes T=3, T=4 y prolatos de GII.17 Kawasaki.

La comparación de instrumentos marca el rumbo de la estrategia futura

El calentamiento gradual de la entrada en el Xevo CDMS redujo la masa medida hasta acercarla a los valores teóricos, lo que constituye una herramienta práctica para separar la masa real de las partículas de las contribuciones de los aductos.

Puntos clave:

  • Xevo CDMS ofrece un flujo de trabajo optimizado con visualización de datos en tiempo real y una precisión en el pesaje de ±1 %.
  • La deconvolución DMT más UCD reduce la anchura del pico en aproximadamente un 50 %, pero requiere una aplicación cuidadosa para evitar artefactos.
  • Los patrones de calibración adaptados al analito son fundamentales: ambas plataformas mostraron desviaciones de masa relacionadas con la falta de correspondencia en el tamaño de los patrones de calibración.

Lee el artículo completo,«Aplicación de distintas estrategias de CDMS para observar el ensamblaje no clásico de la cápside viral», para descubrir cómo dos plataformas de CDMS, combinadas, revelan toda la complejidad de las poblaciones de VLP del norovirus.