Guía completa para la identificación y caracterización de proteínas

La identificación y caracterización de proteínas es uno de los componentes más importantes de la expresión y fabricación de proteínas recombinantes para productos biológicos. Implica una amplia variedad de herramientas y técnicas analíticas debido a la gran complejidad de las proteínas en sí mismas, que comienzan con 21 aminoácidos dispuestos de formas casi infinitas y luego se pliegan en estructuras tridimensionales.  

Comprender la estructura de una proteína es fundamental para comprender su función, y la creación de terapias biológicas, incluyendo anticuerpos, proteínas recombinantes, vacunas y otras moléculas, depende de una caracterización clara y precisa. 

Métodos de identificación de proteínas 

• Espectrometría de masas (MS): primero se ionizan las proteínas completas y, a continuación, se introducen en un analizador de masas o se identifican a nivel peptídico. El espectrómetro identifica la estructura de las proteínas mediante huellas de masas o espectrometría de masas en tándem. Las masas peptídicas se comparan con bases de datos en línea para encontrar las proteínas más similares. 
• Degradación de Edman: purifica las proteínas eliminando un residuo cada vez del extremo amino de un péptido, utilizando isotiocianato de fenilo. El proceso no daña la proteína y separa un residuo cada vez, pero no es tan útil para proteínas más grandes.   
• Huella peptídica: este método de alto rendimiento utiliza endoproteasas que descomponen proteínas desconocidas en péptidos más pequeños. La masa de estos péptidos se puede medir mediante MS, y las listas resultantes de «picos peptídicos» se comparan con bases de datos de proteínas.  
• Búsqueda en bases de datos y herramientas bioinformáticas: los datos obtenidos mediante espectrometría de masas y huellas genéticas se comparan utilizando programas informáticos y bases de datos para encontrar la coincidencia más cercana con su muestra.  
• Inmunoensayos: identifican proteínas mediante sus interacciones con anticuerpos específicos. Estas pruebas incluyen ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas), western blotting (separación de proteínas por peso molecular, transferencia por electroforesis a una membrana y sondeo con anticuerpos) e inmunoprecipitación (precipitación de un antígeno proteico fuera de la solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína). 
• Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC): mediante el uso de perlas de dimensiones específicas empaquetadas en una columna, estos métodos separan las proteínas según su tamaño. Cuando las muestras entran en la columna, las diferentes moléculas tendrán diferentes velocidades de elución.  
• Cromatografía de afinidad: esta técnica también utiliza una columna y perlas de celulosa. Un sustrato (o, en ocasiones, una coenzima) se une covalentemente a las perlas en la parte superior de la columna. Las proteínas que tienen un sitio de unión para el sustrato inmovilizado se unirán, mientras que todas las demás proteínas se eluirán. 

Técnicas de caracterización de proteínas

La caracterización de proteínas permite dilucidar la secuencia primaria, la estructura de orden superior, las modificaciones postraduccionales, las interacciones y las actividades biológicas de las proteínas. La caracterización de proteínas implica una amplia gama de herramientas y técnicas analíticas. No existe una tecnología «única» para determinar la composición química, la estructura y la función de moléculas grandes con diferentes estados de agregación, cargas, tamaños y configuraciones tridimensionales. Sin embargo, la caracterización de las proteínas de sus muestras, especialmente las terapéuticas potenciales, es de vital importancia para determinar la seguridad, la eficacia y la pureza de sus terapias basadas en proteínas.  

Equipo de análisis de proteínas 

El análisis de proteínas implica el uso de herramientas que detectan, purifican e identifican proteínas, y comienzan a caracterizar su estructura y función. Los equipos pueden incluir métodos tradicionales como la electroforesis, que separa las proteínas por tamaño y carga, el western blotting, que marca los objetivos con anticuerpos, y la espectrometría de masas, que mide las relaciones masa-carga. Entre los métodos más modernos se encuentra la dispersión dinámica de luz (DLS).  

• La separación de proteínas (electroforesis) colocalas proteínas en un gel y observa su movilidad en presencia de un campo eléctrico. Las proteínas se pueden separar por solubilidad, tamaño, carga y unión. La más común es la SDS-PAGE (abreviatura de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio), que separa las proteínas en función de su peso molecular.  
• El Western blotting identificalas proteínas extraídas de las células, las separa por tamaño, las transfiere a un soporte sólido (el blot) y utiliza anticuerpos primarios y secundarios para localizar las proteínas, lo que permite identificarlas en función de sus asociaciones biológicas.  
• La dispersión de la luz es un método más moderno y más sensible con moléculas más grandes. Por ejemplo, el DLS puede detectar con precisión pequeñas cantidades de agregados polipeptídicos en preparaciones.La familia Aura Systems midecon precisión la distribución del tamaño de las partículas, basándose en la imagen de membrana con fondo (BMI) y la microscopía de membrana por fluorescencia (FMM). Estos instrumentos proporcionan información valiosa sobre la distribución del tamaño de las partículas en una muestra, lo que ayuda a los investigadores y fabricantes a comprender las características de sus productos. 

Instrumentos para la formulación de productos biológicos 

Durante la fabricación de moléculas terapéuticas, es importante contar con los instrumentos adecuados para supervisar la conformación de las proteínas, predecir la estabilidad térmica y medir la formación de agregados.  

Calorimetría diferencial de barrido (DSC) caracteriza la estabilidad térmica de las proteínas midiendo la entalpía (ΔH) y la temperatura (Tm) de las transiciones estructurales inducidas térmicamente de las moléculas. El DLS puede analizar la movilidad y la carga de las partículas (potencial zeta) utilizando la técnica de dispersión electromotriz de la luz (ELS), y el peso molecular de las partículas en solución utilizando la dispersión estática de la luz (SLS). Otros sistemas, como Aura PTx System, utilizar IMC con dos canales de FMM para detectar e identificar partículas subvisibles que pueden formar agregados y amenazar la estabilidad de los productos biológicos. Además, el FMM permite caracterizar también los excipientes de las formulaciones, como el polisorbato. 

Herramientas para la caracterización de proteínas 

Cromatografía:La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la cromatografía de intercambio iónico (IEC) y la cromatografía de afinidad separan las proteínas en función de su tamaño, carga, hidrofobicidad o interacciones específicas, lo que permite analizar la pureza y separar las isoformas o variantes de las proteínas. 

Electroforesis:la SDS-PAGE, el enfoque isoeléctrico (IEF) y la electroforesis capilar (CE) separan las proteínas en función de su tamaño, carga o punto isoeléctrico, lo que facilita el análisis de pureza, la composición de subunidades y las modificaciones postraduccionales. 

MS:La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) y la espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS) identifican y cuantifican proteínas, péptidos y modificaciones postraduccionales, lo que permite dilucidar la secuencia primaria, las variaciones estructurales y las interacciones. 

Espectroscopia:La espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), la espectroscopia de fluorescencia, el dicroísmo circular (CD) y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) permiten el análisis estructural de las proteínas, así como el análisis del plegamiento, los cambios conformacionales y la unión de ligandos. 

The Aura Systems family (en particular, el sistema Aura PTx para proteínas) utiliza una combinación de BMI, un método de microscopía, y microscopía de membrana por fluorescencia, que utiliza tintes fluorescentes o anticuerpos para una caracterización más rápida y fiable, todo en un solo instrumento. Con los sistemas Aura, los investigadores pueden comprender la estabilidad y la pureza de las proteínas que se producen. 

Ensayos de caracterización de proteínas 

Ensayos biofísicos:DLS y DSC caracterizan el tamaño, la forma y la estabilidad de las proteínas, así como sus interacciones con ligandos u otras moléculas. 

Ensayos inmunológicos: ELISA, Western blotting, inmunoprecipitación y citometría de flujo detectan y cuantifican proteínas, epítopos o interacciones proteína-proteína específicas, lo que facilita los inmunoensayos, la detección de biomarcadores y los estudios de interacción proteína-proteína. 

Formulación proteica 

El proceso de ensamblaje de la estructura primaria de las proteínas (aminoácidos), seguido de las estructuras secundaria y terciaria (tridimensional) en los productos farmacéuticos proteicos finales, requiere pasos que garanticen la estabilidad, la integridad estructural y la función. La proteína debe estabilizarse para que tolere los procesos de fabricación y se mantenga estable y activa durante el transporte, el almacenamiento y la administración. El desarrollo de la formulación tiene como objetivo garantizar la estabilidad, la eficacia, la seguridad y la capacidad de fabricación de los productos biofarmacéuticos mediante la selección de excipientes, tampones, pH y formas de dosificación adecuados. 

Entre los factores que influyen en la estabilidad y la eficacia se encuentra la formación de agregados, que afecta a la estructura de las proteínas (y, por lo tanto, a su función). Es importante distinguir los ingredientes farmacéuticos activos (API) agregados de otros tipos de partículas para comprender la causa fundamental de la inestabilidad.  The Aura PTx System’s  El sistema de imagen de agregados y partículas de 96 pocillos puede medir, contar y caracterizar rápidamente las partículas e identificarlas como proteínas, no proteínas, excipientes u otros tipos de moléculas. Este sistema es mucho más eficiente y preciso que los sistemas tradicionales de celda de flujo utilizados para distinguir el tamaño y el recuento de las proteínas.  

Análisis de agregación de proteínas 

Los agregados en las muestras de proteínas suelen ser segmentos de cadenas polipeptídicas rotas que «se suman» durante la fabricación de terapias proteicas. Sin embargo, pueden reducir significativamente la estabilidad de la proteína objetivo y disminuir la eficacia de un agente terapéutico. Además, la exposición al aire, a sólidos, a la luz o a cambios de temperatura (que a menudo forman parte del proceso de desarrollo farmacéutico) puede producir partículas proteicas. 

Las terapias proteicas exitosas requieren mediciones de la calidad del producto en las últimas etapas de descubrimiento y en las primeras etapas de desarrollo que detecten, cuenten y caractericen los excipientes de la formulación, garantizando la estabilidad de las proteínas. Sin embargo, los métodos tradicionales requieren horas de clasificación de imágenes y volúmenes relativamente grandes, además de la adopción de complejas bibliotecas de aprendizaje automático, y a menudo pasan por alto agregados clave de muestras y compuestos degradados. Aura PTx System, con su combinación de BMI y dos canales FMM, proporciona rápidamente el recuento, el tamaño y la morfología, y diferencia los agregados celulares, proteicos o extrínsecos. 

Caracterización del peso molecular 

Las técnicas para caracterizar proteínas por peso molecular incluyen SDS-PAGE, MALDI-TOF MS y SEC o SEC-MALS. SDS-PAGE es la técnica más común y separa las proteínas por peso molecular (y no por carga o plegamiento). Se utiliza a menudo en bioquímica, medicina forense, genética y biología molecular. MALDI-TOF es una forma de espectrometría de masas que determina la relación entre la masa y la carga, lo que permite determinar las masas y la composición elemental de las proteínas. Una vez desarrollado el MALDI, esta técnica se popularizó para el estudio de las proteínas. La SEC, también conocida como filtración en gel o HPLC, es una potente técnica para el análisis de agregados y fragmentos en la investigación, el desarrollo y la fabricación de proteínas bioterapéuticas, como la insulina y los anticuerpos monoclonales.  

Análisis de pureza mediante HPLC 

La HPLC, como se ha mencionado anteriormente, se utiliza para estudios de pureza de proteínas. Permite una separación altamente selectiva del material de la muestra. La HPLC separa las moléculas en función de su tamaño mediante filtración a través de un gel. El gel está compuesto por perlas que contienen poros con una distribución de tamaño, carga y/o afinidad específicos. La separación se produce cuando moléculas de diferentes tamaños, cargas o afinidades son incluidas o excluidas de los poros dentro de la matriz. Los analitos más grandes se eluirán primero, mientras que las moléculas más pequeñas interactúan más con la fase estacionaria y se eluirán más tarde. 

Análisis de variantes de carga proteica 

Las proteínas bioterapéuticas de gran tamaño pueden sufrir modificaciones enzimáticas postraduccionales durante su fabricación, como la glicosilación y el truncamiento de lisina. Además, pueden producirse modificaciones químicas durante la purificación y el almacenamiento. Por este motivo, la FDA y otros organismos reguladores exigen que estas proteínas se sometan a un análisis de variantes de carga. Este análisis se ha realizado tradicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico con gradientes de sal, mientras que las técnicas más recientes se basan en gradientes de pH en lugar de sal. La focalización isoeléctrica mediante CE también se ha utilizado como método global rápido, pero sigue teniendo tiempos de ejecución más largos y es propensa a errores humanos. A menudo requiere una muestra muy pura, ya que no puede manejar bien muestras contaminadas o heterogéneas.  

Agregación y análisis de contenido fragmentado 

Los agregados y fragmentos son impurezas comunes en los productos biofarmacéuticos que afectan a la eficacia, seguridad y estabilidad del producto. La SEC se puede combinar con la ionización por electrospray MS para caracterizar las variantes de tamaño de los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs). La MS de tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF) también se puede optimizar para obtener una mayor sensibilidad. Además, la ultracentrifugación analítica puede ayudar a separar los fragmentos. 

Identificación y cuantificación de residuos de proteínas de células huésped 

Las proteínas de la célula huésped son impurezas producidas por el organismo huésped durante la fabricación de productos bioterapéuticos. La purificación suele eliminar la mayor parte de estos residuos del producto final, pero las proteínas residuales que permanecen en la terapia con anticuerpos fabricada, incluso en niveles bajos, pueden ser inmunogénicas. La FDA y otros organismos reguladores exigen actualmente que prácticamente no haya impurezas proteicas en un producto bioterapéutico final. Las técnicas de MS son útiles para la identificación y cuantificación de las HCP que permanecen en los productos terapéuticos recombinantes, y suponen una mejora con respecto al ELISA y otros métodos analíticos. Las técnicas analíticas de microscopía BMI y FMM del sistema Aura PTx también pueden ser muy eficaces para detectar proteínas y agregados.  

Cobertura de secuencia/mapeo de péptidos 

Determinar la secuencia exacta y precisa de su proteína terapéutica es fundamental para una caracterización satisfactoria. Este método funciona mediante la digestión de las proteínas hasta sus péptidos fundamentales y garantiza una secuencia completa de la molécula bioterapéutica. Las técnicas para la cobertura de secuencias y el mapeo de péptidos incluyen HPLC y HPLC acoplado con MS. Las técnicas MS pueden proporcionar datos muy precisos y selectivos, especialmente con biomoléculas muy complejas como los mAb.  

Confirmación de la secuencia N-terminal y C-terminal 

El análisis de la secuencia amino (N-terminal) identifica el orden de los aminoácidos de su proteína, comenzando por el extremo N-terminal. Las secuencias N-terminales influyen significativamente en la vida media, la localización subcelular y las modificaciones postraduccionales de las proteínas. Del mismo modo, el análisis de la secuencia C-terminal (terminal ácida) identifica el orden de los aminoácidos en el extremo C-terminal de la proteína. Esto puede proporcionar información sobre el plegamiento de la proteína, la estructura secundaria y la disposición de los dominios funcionales. Los dos métodos principales para llevar a cabo esta confirmación de la secuencia son la MS y la degradación de Edman.  

Análisis de modificaciones postraduccionales 

Las modificaciones postraduccionales (PTM) son variantes que se introducen en las proteínas después de su expresión. Los estudios epigenéticos han demostrado que las PTM pueden ser inocuas o pueden alterar drásticamente la función de las proteínas, por lo que es necesario detectar los efectos de las PTM en cualquier producto bioterapéutico. Las PTM comunes pueden variar desde las más simples hasta las más complejas, e incluyen fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación, lipidación y proteólisis. En la mayoría de los casos son enzimáticas (causadas por la acción de enzimas). Las técnicas para identificar y analizar las PTM pueden variar según el tipo de PTM e incluyen SDS-PAGE, Western blotting, inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y otras técnicas.  

Análisis de enlaces disulfuro 

Los enlaces disulfuro son enlaces covalentes entre los átomos de azufre que se encuentran en los residuos del aminoácido cisteína. Son el único enlace covalente que se encuentra entre los polipéptidos y estabilizan la estructura de las proteínas. Los agentes reductores como el clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), el beta-mercaptoetanol (BME) y el ditiotreitol (DTT) pueden romper los enlaces disulfuro y, por lo tanto, la estabilidad de las proteínas. El análisis de los enlaces disulfuro se realiza normalmente mediante MS y HPLC.  

Análisis de modificaciones por glicosilación 

La glicosilación de proteínas es una importante modificación postraduccional (PTM) y puede alterar el plegamiento, la conformación, la distribución, la estabilidad y la actividad de las proteínas. La glicosilación implica la adición de una variedad de azúcares a las proteínas, que luego controlan la unión celular a la matriz extracelular y las interacciones proteína-ligando en la célula. Las glicoproteínas se detectan, purifican y analizan mediante, en orden, tinción y visualización de glicanos, entrecruzamiento de glicanos con agarosa o resina magnética para el marcaje o la purificación, o análisis proteómico por MS.  

Análisis de sitios de glicosilación y glicoformas 

La glicosilación variará según el lugar de la célula en el que se una la molécula de azúcar y según la estructura y el sitio de unión química de la molécula de azúcar. Estos oligosacáridos pueden afectar a las interacciones proteína-proteína, ya sea permitiendo o bloqueando la unión de las proteínas a los dominios de interacción cognados. Dado que son hidrófilos, también pueden alterar la solubilidad de las proteínas. Las técnicas de análisis incluyen la tinción de glicanos, el enriquecimiento y el análisis mediante lectinas y la espectrometría de masas. 

Análisis del ácido siálico 

El ácido siálico es el azúcar más prevalente que se encuentra en la superficie de las células de los mamíferos. Es esencial para la adhesión celular y la modulación inmunitaria, y se une a selectinas y lectinas. Las directrices ICH Q6B para la producción biofarmacéutica exigen el análisis del ácido siálico y los monosacáridos. Normalmente, el ácido siálico se cuantifica mediante marcaje fluorescente y análisis mediante HPLC con detección fluorescente.  

Descripción general: Tecnología de caracterización de proteínas 

Las proteínas son posiblemente las moléculas más complejas de las células y tejidos vivos, y su uso como productos biofarmacéuticos requiere la integración de diversas tecnologías para realizar análisis exhaustivos que garanticen su seguridad y eficacia.  

Caracterización de MS 

Como se ha descrito anteriormente, la MS es una herramienta muy valiosa para caracterizar y analizar proteínas, así como fragmentos, agregados y PTM que pueden afectar al desarrollo y la estabilidad de las proteínas. Las técnicas de MS se utilizan para determinar la estructura, la función, el plegamiento y las interacciones, identificar proteínas a partir de su masa de fragmentos peptídicos y contar con precisión las proteínas de una muestra. El desarrollo de la proteómica MS cuantitativa y de alto rendimiento en los últimos 20 años ha ampliado el alcance de la MS. 

Caracterización mediante espectrometría CD 

El CD mide la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha por compuestos ópticamente activos a diferentes longitudes de onda. La luz incidente sobre la muestra cambia entre luz LCP y RCP. A medida que la luz incidente cambia la dirección de polarización, la absorción cambia y se puede calcular la absorbancia molar diferenciada. La CD permite estudiar los cambios en la estructura secundaria y sentar las bases para un análisis conformacional de las proteínas. La CD también se puede utilizar para examinar la estabilidad de las proteínas y los ácidos nucleicos (plegamiento, desplegamiento y repliegamiento) en presencia de pH, desnaturalizantes, temperatura y otros factores.  

FMM/SIMI/BMI 

Constituye la base del análisis de proteínas y fragmentos de proteínas realizado con Aura Systems. Aura PTx System es el primer y único sistema que combina IMC) con dos FMM) Canales para proporcionar rápidamente recuento, tamaño, identificación, imágenes y morfología con agregados celulares y proteicos diferenciados, excipientes como polisorbato degradado y/o caracterización de partículas extrínsecas. 

DLS 

El DLS se utiliza para medir partículas de entre 0,2 nm y 10 µm. Estos instrumentos funcionan utilizando el movimiento browniano, en el que las partículas más ligeras se mueven más rápido que las más pesadas (y, por lo tanto, más grandes). Un láser ilumina las partículas y se analiza la luz dispersada. Las fluctuaciones en la intensidad determinan la distribución del tamaño en una muestra. 

Caracterización mediante cristalografía de rayos X 

La cristalografía de rayos X se basa en la captura de imágenes de rayos X a medida que atraviesan una forma cristalizada de una molécula objetivo (en este caso, una proteína). Es una forma precisa de determinar la estructura tridimensional de una proteína. Para utilizar esta técnica, el cristalógrafo obtiene cristales de proteínas, registra el patrón de difracción formado por los rayos X que atraviesan los cristales y, a continuación, interpreta los datos mediante un programa informático. El resultado es un modelo de resolución atómica de una proteína. 

Caracterización mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear 

La resonancia magnética nuclear (RMN) se produce cuando los núcleos de un campo magnético inmóvil son perturbados por un campo magnético oscilante; los núcleos generan una señal electromagnética, cuya frecuencia depende del campo magnético aplicado. Junto con la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica, la RMN es una de las tres técnicas que se utilizan para dilucidar la estructura de las proteínas. A diferencia de la imagen magnética nuclear, la RMN de proteínas utiliza algoritmos para crear modelos tridimensionales de la muestra de interés. La RMN de proteínas se realiza con muestras completamente purificadas. 

Caracterización mediante microscopía electrónica criogénica 

Otra técnica que permite determinar la estructura de una proteína, la crio-EM, es una tecnología emergente y prometedora para obtener estructuras de proteínas de membrana de alta resolución, lo que no es posible con otras técnicas como la RMN o la cristalografía de rayos X. La crio-EM consta de varias aplicaciones, como el análisis de partículas individuales (SPA), la tomografía crioelectrónica (cryoET) y la microdifracción de electrones (MicroED). Ha supuesto una revolución en la biología estructural, la investigación de enfermedades infecciosas y el descubrimiento de fármacos. 

Avances en la caracterización de proteínas 

Debido a la naturaleza compleja (por no mencionar la importancia) de las proteínas, es necesario desarrollar enfoques integradores que combinen múltiples técnicas para el análisis exhaustivo y la caracterización de las proteínas. Las tendencias futuras en la caracterización parecen apuntar hacia un mayor rendimiento y una mejor resolución a nivel atómico, así como hacia la capacidad de determinar de forma rápida y fiable las proteínas no proteicas y los fragmentos y agregados proteicos, especialmente a medida que se desarrollan y comercializan más productos bioterapéuticos basados en proteínas.  

Referencias

https://www.usp.org/biologics/proteins

https://www.biopharminternational.com/view/usp-standards-to-support-the-characterization-of-mabs-applications-and-general-chapter-129