La importancia de la caracterización del AAV para garantizar el desarrollo seguro de la terapia génica

Las cápsides del virus adenoasociado (AAV) se han convertido en las favoritas para la administración de genes in vivo gracias a su perfil de seguridad único y su capacidad para proporcionar una expresión génica a largo plazo. Con múltiples serotipos de vectores AAV recombinantes utilizados en diversos programas de terapia génica, este campo está experimentando un crecimiento sin precedentes.

En abril de 2020, hay 244 ensayos clínicos activos en todo el mundo relacionados con la terapia génica con AAV, incluidos 24 ensayos clínicos de fase III. Aun así, el camino hacia el desarrollo de análisis exhaustivos de AAV para el desarrollo de procesos y la evaluación final de los medicamentos no está exento de obstáculos.

Preciso AAV characterization es crucial para garantizar la eficacia de las terapias génicas. Visible y partícula subvisible (SVP) El análisis desempeña un papel fundamental en este proceso. Sin embargo, cuando se aplica a terapias génicas basadas en AAV, presenta un reto único debido a la disponibilidad limitada de material para las pruebas. Los métodos actuales de caracterización del AAV incluyen la dispersión dinámica de luz (DLS) y la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que se utilizan habitualmente para caracterizar poblaciones de AAV solubles y submicrométricas. Aunque son muy informativas, estas técnicas no proporcionan una visión completa, ya que se centran principalmente en los AAV solubles y estables. Es igualmente importante estudiar los AAV insolubles e inestables para identificar posibles vulnerabilidades o irregularidades y garantizar su uso seguro y eficaz.

Técnicas como la oscurecimiento de la luz (LO) y la imagen de flujo (FI) se utilizan para caracterizar las poblaciones de partículas insolubles en las formulaciones de AAV, proporcionando información sobre especies más grandes y heterogéneas. Sin embargo, requieren grandes volúmenes de material, pueden ser costosas y llevar mucho tiempo, lo que crea cuellos de botella en el desarrollo y la fabricación de terapias génicas.

Enfoques analíticos tradicionales frente a enfoques analíticos novedosos para caracterizar el AAV

Garantizar la calidad constante de las terapias génicas con AAV depende de la capacidad de caracterizar rápidamente los atributos críticos de calidad (CQA). Esto incluye la medición del título viral, el contenido de la cápside y la agregación, todos los cuales influyen en la potencia, la pureza y la seguridad de los AAV. Lamentablemente, los métodos de caracterización de AAV existentes para medir estos atributos suelen llevar mucho tiempo o no funcionan bien para el desarrollo de procesos, pero se están desarrollando nuevos métodos analíticos de AAV rápidos y de alto rendimiento.

En unestudiopublicado recientemente enScience Direct, los investigadores examinaron tanto las técnicas convencionales como las emergentes para medir los atributos de calidad del AAV recombinante (rAAV).

Los rAAV son un vector prometedor para la terapia génica, pero sus atributos de calidad deben analizarse cuidadosamente para garantizar su seguridad y eficacia. Los análisis tradicionales de AAV y los ensayos de control de calidad requieren mucho tiempo y pueden no ser adecuados para los plazos de desarrollo rápido de productos. Los métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento para AAV pueden proporcionar resultados útiles con rapidez, pero su desarrollo e implementación pueden resultar difíciles debido a las cantidades limitadas de muestras y a los efectos de la matriz.

A pesar de estos retos, se han logrado avances significativos en el desarrollo de métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento para la caracterización del rAAV, especialmente para tres CQA potenciales: título de cápside, ratio de contenido y contenido de agregados. Ahora se pueden utilizar métodos basados en cromatografía y dispersión de luz para caracterizar estas CQA directamente o en línea, lo que permite la supervisión y el control del proceso en tiempo real.

Según los autores del artículo, algunas de las principales ventajas de los métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento para la caracterización del rAAV son:

• Desarrollo más rápido de productos: los métodos analíticos rápidos pueden ayudar a acelerar el desarrollo de productos al proporcionar información oportuna sobre el rendimiento del proceso y la calidad del producto.
• Reducción de costes: los métodos analíticos rápidos pueden ayudar a reducir los costes al disminuir el tiempo y los recursos necesarios para las pruebas de control de calidad.
• Mejora de la calidad del producto:los métodos analíticos rápidos pueden ayudar a mejorar la calidad del producto al permitir la supervisión y el control del proceso en tiempo real.

Sin embargo, siguen existiendo retos:

• Cantidades limitadas de muestras:la producción de rAAV suele generar solo pequeños volúmenes de producto purificado, lo que puede limitar la cantidad de muestra disponible para el análisis.
• Efectos de matriz: Lapresencia de otras moléculas en la muestra de rAAV, como tampones, ADN o proteínas residuales, o sales iónicas, puede interferir en las mediciones analíticas.
• Desarrollo de métodos:El desarrollo de métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento que sean precisos, fiables y reproducibles puede resultar complicado.

Los autores concluyeron que será fundamental desarrollar métodos analíticos de AAV que puedan soportar plazos cortos y un alto rendimiento en el desarrollo de procesos, al tiempo que mantengan la reproducibilidad y la especificidad.

Más allá de los métodos tradicionales de caracterización de AAV: obtención de un conocimiento más profundo de las muestras con Aura

Caracterizar la agregación y la estabilidad del AAV en volúmenes ultrabajos es fundamental para lograr la pureza del producto y evitar fugas o contaminaciones de ADN. Los avances tecnológicos han abierto nuevas posibilidades en este ámbito, por lo que ahora es posible detectar rápidamente la inestabilidad y caracterizar la agregación del AAV en volúmenes ultrabajos, lo que resulta muy útil para el desarrollo de terapias génicas. Con la tecnología Side Illumination Membrane Imaging (SIMI) y Fluorescence Membrane Microscopy (FMM) de Aura System, combinada con las capacidades de índice de refracción de BMI, se puede obtener una comprensión más profunda de las muestras para identificar el contenido de proteínas o no proteínas junto con elementos intrínsecos o extrínsecos, algo que los analizadores de partículas tradicionales basados en flujo no podían proporcionar. Esto permite una mayor protección contra costosas retiradas de productos debido a la contaminación por partículas invisibles.

A diferencia de la imagen de flujo, que requiere mililitros de muestra, Aura Systems Puede caracterizar rápida y fácilmente vectores virales y otros tipos de terapias génicas con solo 5 µL de muestra. Esto se debe al análisis de muestras mediante microscopía de membrana, que requiere cantidades meniscales y mantiene una eficiencia de muestreo del 100 %.

Aura GT System’s technology also allows for AAV characterization with high throughput (<1 min/sample), quickly revealing insights into their stability. The system helps to ensure that a gene therapy’s most important stability characteristic — its SVP concentration — can be monitored throughout process development and through quality control testing.

Emplear múltiples métodos analíticos de AAV

Al implementar un método analítico rápido para la caracterización del AAV, puede comenzar la selección y el cribado de candidatos mucho antes en el desarrollo, lo que le proporciona la confianza necesaria para comercializar su terapia génica.

Referencias

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