De los complejos ocultos al conocimiento de las dianas farmacológicas gracias al CDMS y la criomicroscopía electrónica (Cryo-EM)

Un estudio reciente publicado en JACS, realizado por el profesor Siavash Vahidi y sus colaboradores de la Universidad de Guelph (Canadá), pone de relieve cómo la espectrometría de masas con detección de carga (CDMS) puede revelar ensamblajes proteicos ocultos que los métodos convencionales suelen pasar por alto. Al orientar la microscopía electrónica criogénica (crio-EM) hacia poblaciones estructuralmente distintas, la CDMS permitió comprender en mayor profundidad la arquitectura activa y el mecanismo de reconocimiento del sustrato de una diana farmacológica validada contra la tuberculosis.

El reto biológico

La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las enfermedades infecciosas más mortíferas del mundo, ya que solo en 2024 se cobró más de 1,2 millones de vidas. A medida que siguen apareciendo cepas resistentes a los medicamentos, existe una necesidad urgente de encontrar nuevas dianas terapéuticas. Una diana prometedora es el activador bacteriano del proteasoma Bpa, una proteína presente en Mycobacterium tuberculosis que no tiene ningún homólogo conocido en el ser humano.

Sin embargo, comprender cómo la Bpa reconoce y transporta los sustratos para su degradación ha resultado complicado, ya que se presenta en múltiples ensamblajes oligoméricos estrechamente relacionados entre sí que son difíciles de distinguir mediante métodos analíticos convencionales.

¿Por qué seguía sin estar claro el panorama general?

Varios estudios en los que se han utilizado técnicas como la cristalografía de rayos X, la criomicroscopía electrónica (cryo-EM), la SEC-MALS y la espectrometría de masas nativa convencional han descrito que el Bpa forma un anillo dodecámero. Sin embargo, estos métodos agrupan en un promedio especies estructuralmente similares, lo que dificulta distinguir entre ensamblajes estrechamente relacionados que solo difieren sutilmente en masa y tamaño.

Dado que un posible anillo de 11 subunidades difiere del dodecámero en menos del 10 % de su masa, podrían existir estados oligoméricos alternativos que, a pesar de estar a la vista, pasan desapercibidos, lo que dificulta una comprensión completa de la estructura y la función de la Bpa.

El hallazgo del CDMS que cambió el rumbo de la historia

El CDMS reveló que la apo Bpa se presenta como una mezcla de anillos de 11 y 12 subunidades, hasta entonces desconocidos, y estableció una estequiometría de unión de 12:2 entre la Bpa y la HspR. Además, demostró que la unión del sustrato favorece el dodecámero completamente ensamblado, lo que aportó pruebas fundamentales que sirvieron de guía para el posterior análisis mediante criomicroscopía electrónica.

Estos resultados han sido posibles gracias a que el CDMS mide directamente tanto la masa como la carga de cada ion, lo que permite separar conjuntos estrechamente relacionados incluso cuando, en la espectrometría de masas convencional, aparecen como una única población.

La crio-microscopía electrónica convirtió el descubrimiento del CDMS en información estructural

La crio-microscopía electrónica transformó el descubrimiento del CDMS en conocimiento estructural al revelar cómo el sustrato nativo HspR se une al Bpa. Guiados por los datos del CDMS, los investigadores resolvieron tanto los ensamblajes de Bpa de 11 mer, hasta entonces desconocidos, como los ya conocidos de 12 mer, y obtuvieron una estructura de 3,9 Å del complejo Bpa:HspR.

Estas estructuras revelaron que la proteína HspR se asocia preferentemente con el dodecámero completamente ensamblado y permitieron localizar la región responsable del reconocimiento del sustrato. Cabe destacar que el ensamblaje undecámero no se detectó en el análisis inicial por criomicroscopía electrónica.

Fue precisamente esa población inesperada identificada por el CDMS la que llevó a los investigadores a perfeccionar su estrategia de clasificación y reconstrucción, lo que permitió obtener una visión más completa del panorama estructural del sistema.

La idea clave

Las poblaciones estructurales ocultas pueden ser la clave para comprender la función biológica. Este estudio ha demostrado cómo la técnica CDMS ha permitido descubrir lo que los métodos convencionales pasaban por alto y cómo la criomicroscopía electrónica (cryo-EM) ha traducido ese descubrimiento en un conocimiento estructural, aportando nuevos datos sobre una diana farmacológica validada contra la tuberculosis.

Lee el artículo completo, «Resolución deestequiometrías ocultas en complejos de activador proteasómico bacteriano (Bpa) y sustratos mediante criomicroscopía electrónica y espectrometría de masas con detección de carga», para descubrir cómo puedes utilizar la CDMS y la criomicroscopía electrónica para mejorar tus análisis de proteínas.