Metodologías de caracterización biofísica

La caracterización biofísica de las proteínas es un paso necesario en la producción y el desarrollo de terapias proteicas, ya que permite comprender de forma exhaustiva la función y la estructura de una proteína. Mediante el análisis y la definición de la estructura de orden superior de posibles dianas farmacológicas, este proceso sirve para identificar y mitigar problemas que podrían afectar significativamente a la eficacia y la seguridad de un producto, como la falta de estabilidad y la agregación.^1,2

Además, la caracterización biofísica es una herramienta clave en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos, ya que facilita la identificación y evaluación de posibles dianas farmacológicas y su interacción con compuestos terapéuticos. Gracias a sus conocimientos fundamentales sobre la dinámica estructural de las proteínas terapéuticas, la caracterización biofísica desempeña un papel clave en la optimización del proceso de diseño de fármacos y en garantizar que los tratamientos que pueden salvar vidas se desarrollen teniendo en cuenta la seguridad y la eficacia.³

Técnicas comunes de caracterización biofísica

En lo que respecta a los métodos biofísicos para la caracterización de proteínas, los investigadores disponen de numerosas opciones para analizar la estructura secundaria y terciaria de una molécula, así como su agregación. 

Estructura secundaria y terciaria

• Calorimetría diferencial de barrido (DSC): esta técnica analítica ampliamente reconocida permite medir la capacidad calorífica molar de las muestras en función de la temperatura. Ha demostrado ser especialmente útil para evaluar la estabilidad térmica de las biomoléculas, incluidas las proteínas.
• Dicroísmo circular (CD): Esta técnica permite evaluar rápidamente la estructura secundaria, las características de plegamiento y las propiedades de unión de las proteínas. Básicamente, el dicroísmo circular consiste en la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente hacia la izquierda y hacia la derecha. Además, el dicroísmo circular se puede utilizar para investigar las interacciones proteicas y evaluar la desnaturalización térmica de las proteínas y la unión de ligandos. Sin embargo, estas aplicaciones se consideran métodos de bajo rendimiento, lo que indica que pueden no ser adecuadas para estudios a gran escala o de gran volumen.^4,5
• Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR): Esta técnica no invasiva para el análisis de la estructura de las proteínas utiliza energías fotónicas mínimas para evitar reacciones no deseadas. Evita el calentamiento de la muestra, requiere pequeñas cantidades de muestra y no necesita una pureza elevada. Su resolución temporal intrínseca es de unos pocos picosegundos. Sin embargo, carece de selectividad de enlaces, lo que da lugar a contribuciones proteicas superpuestas.⁶
• Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN): Se trata de un método no destructivo para estudiar la estructura de las moléculas a nivel atómico, que ofrece información sobre la dinámica y las interacciones moleculares. Sin embargo, tiene sus limitaciones. Entre ellas se incluyen la baja sensibilidad a concentraciones inadecuadas de muestras, lo que da lugar a espectros deficientes; los altos costes asociados a los instrumentos y su mantenimiento, debido a la necesidad de imanes potentes y líquidos refrigerantes; y la dificultad para analizar moléculas de mayor peso molecular, debido a la complejidad de la interpretación de los espectros.⁷

Agregación de productos biológicos

• Cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS): como método biofísico preciso y adaptable para la caracterización de proteínas y agregados, este método es capaz de determinar la composición, la masa y el estado oligomérico de las proteínas de membrana en soluciones detergentes.
• Ultracentrifugación analítica (AUC): Se trata de una técnica muy eficaz para detectar agregados y sensible a la forma molecular de las proteínas. A menudo se emplea para determinar el estado de oligomerización de las proteínas, estimar las constantes de disociación y evaluar el impacto de los tampones en la solubilidad de las proteínas. A pesar de su amplio uso y sus resultados precisos, la AUC es un proceso que requiere mucho tiempo. Por lo tanto, se utiliza a menudo para confirmar los datos obtenidos mediante métodos de cribado de alto rendimiento, más que como método principal de análisis.⁸
• Dispersión dinámica de luz (DLS): este método se utiliza para analizar el perfil de distribución del tamaño de partículas diminutas en suspensión o polímeros en solución, incluidos los agregados proteicos. Se puede aplicar a proteínas de membrana y es capaz de realizar análisis de alto rendimiento. Sin embargo, la interpretación de los datos puede resultar complicada cuando las muestras son polidispersas o contienen agregados más grandes. Una práctica habitual para mejorar la calidad de los datos es filtrar las muestras antes de realizar las pruebas.⁹
• Microscopía de membrana: esta técnica puede ayudar a reducir el tiempo y el volumen de muestra necesarios para realizar pruebas adecuadas. Por ejemplo, la oscurecimiento de la luz (LO, por sus siglas en inglés), que consiste en pasar un flujo de partículas entre una fuente de luz y un detector, es un protocolo común que fue adaptado del sector de la aviación (que lo utilizaba para el análisis de combustible) por la industria biofarmacéutica para diferenciar las partículas en los medicamentos. Sin embargo, debido a su elevado volumen, no es posible observar partículas en las primeras fases de desarrollo con LO. Además, los productos biológicos son casi invisibles en líquido cuando se obtienen imágenes, ya que los productos biológicos y el medio en el que se encuentran tienen el mismo índice de refracción. Además, LO no permite la identificación individual de partículas, lo que deja a los desarrolladores de fármacos sin saber de dónde proceden las partículas o caracterizando de forma inexacta las terapias de los fármacos.⁹

Una amenaza oculta para el desarrollo de fármacos que requiere la caracterización biofísica de proteínas y agregados. 

La agregación de proteínas es un atributo crítico de calidad (CQA) que puede tener un impacto significativo en la eficacia y seguridad de los productos bioterapéuticos. La evaluación, formulación, supervisión y mitigación de la agregación de proteínas requiere un análisis en profundidad de diversos parámetros, como el tamaño, el recuento, la morfología, la forma y la identificación. Estos métodos biofísicos para la caracterización de proteínas pueden ser complejos, lentos y requerir muchos recursos, además de conocimientos y equipos especializados. 

Afortunadamente, con Aura®’s capacidades de análisis avanzadas, impulsadas por Tecnología de imagen de membrana en segundo plano (BMI) y microscopía de membrana por fluorescencia (FMM). Es posible obtener datos de análisis de partículas claros y rápidos. 

FMM es un innovador método de identificación de partículas que utiliza BMI para detectar y clasificar las partículas más comunes en muestras de bioformulación. Esta avanzada técnica de caracterización biofísica aprovecha el BMI, que captura imágenes de una placa de membrana de 96 pocillos antes y después de la filtración de la muestra, utilizando un análisis de imágenes de alto contraste óptico para distinguir partículas de un tamaño comprendido entre 1 μm y 5 mm, con un rango dinámico de más de 36/mL de recuentos. A continuación, FMM utiliza químicas de colorantes fluorescentes extrínsecos establecidas para analizar las partículas y confirmar su presencia. Al teñir las partículas y extraer información vital sobre su recuento, morfología, tamaño e intensidad de dispersión de la luz a partir de la máscara de partículas generada por el software, FMM ofrece un método invaluable para examinar muestras biológicas complejas. 

Conclusión

Históricamente, los métodos biofísicos tradicionales para la caracterización de proteínas han requerido mucho tiempo y grandes volúmenes de muestras, y solo podían utilizarse en las etapas finales del desarrollo, lo que ya es demasiado tarde si un fármaco es ineficaz o potencialmente dañino. Sin embargo, plataformas innovadoras como Aura, que aprovechan técnicas como las formas contemporáneas de microscopía de membrana, están reduciendo el tiempo y el volumen de muestras necesarios para realizar pruebas adecuadas.

Esta tecnología está impulsando la toma de decisiones durante la fase tardía del descubrimiento y a lo largo del desarrollo, partes del proceso en las que la tecnología convencional de análisis de partículas resulta demasiado engorrosa y consume demasiadas muestras. 

Referencias

1. Solomon, T.L., Delaglio, F., Giddens, J.P., Marino, J.P., Yu, Y.B., Taraban, M.B., Brinson, R.G. «Evaluación analítica y funcional correlacionada de las perturbaciones de la estructura de orden superior debidas a la oxidación de NISTmAb». MAbs, vol. 15, n.º 1, 2023, pp. 2160227. PMC9872951. doi:10.1080/19420862.2022.2160227 
2. Vedadi, M., Arrowsmith, C.H., Allali-Hassani, A., Senisterra, G., Wasney, G.A. «Caracterización biofísica de proteínas recombinantes: clave para un mayor éxito en la genómica estructural». J Struct Biol, vol. 172, n.º 1, 2010, pp. 107-19. PMC2954336. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005 
3. Kwan, T.O.C., Reis, R., Siligardi, G., Hussain, R., Cheruvara, H., Moraes, I. «Selección de métodos biofísicos para la caracterización de proteínas de membrana». Int J Mol Sci, vol. 20, n.º 10, 2019, p. 2605. PMC6566885. doi:10.3390/ijms20102605 
4. Durowoju, I.B., Bhandal, K.S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. «Calorimetría diferencial de barrido: un método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación del antígeno proteico». J Vis Exp, n.º 121, 2017, p. 55262. PMC5409303. doi:10.3791/55262 
5. Vedadi, M., Arrowsmith, C.H., Allali-Hassani, A., Senisterra, G., Wasney, G.A. «Caracterización biofísica de proteínas recombinantes: clave para un mayor éxito en la genómica estructural». J Struct Biol, vol. 172, n.º 1, 2010, pp. 107-19. PMC2954336. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005 
6. «News Medical». El papel del FTIR en el análisis de proteínas y las aplicaciones biomédicas, 18 de julio de 2022,https://www.news-medical.net/news/20220718/The-role-of-FTIR-in-protein-analysis-and-biomedical-applications.aspx 
7. Kaveti, Bhavna. «¿Cuáles son las ventajas y limitaciones de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear?». AZoOptics, 18 de octubre de 2023,https://www.azooptics.com/Article.aspx?ArticleID=2460 
8. Kwan, T. O. C., Reis, R., Siligardi, G., Hussain, R., Cheruvara, H. y Moraes, I. «Selección de métodos biofísicos para la caracterización de proteínas de membrana». Int J Mol Sci, vol. 20, n.º 10, 2019, p. 2605. PMC6566885. doi:10.3390/ijms20102605 
9. «La microscopía de membrana ayuda a garantizar que los medicamentos sean seguros para los pacientes». Photonics.https://www.photonics.com/Articles/Membrane_microscopy_is_helping_to_ensure_that/a68087