Mejora, retención y separación de compuestos polares mediante técnicas cromatográficas

Separar y retener compuestos polares es un reto importante en cromatografía. Aquí exploramos las principales consideraciones técnicas y soluciones para manipular eficazmente estos compuestos, centrándonos en técnicas cromatográficas avanzadas y tecnologías de columna. 

¿Qué son los compuestos polares? 

Los compuestos polares son esenciales en los procesos biológicos, el diseño de fármacos y las aplicaciones industriales debido a su capacidad para interactuar con el agua y otras sustancias polares. Desempeñan un papel fundamental en la solubilidad y el metabolismo de los fármacos, incluidos el ADN y las proteínas. 

Los compuestos polares tienen cargas positivas y negativas distintas en los extremos opuestos. Cuanto mayor es la distancia entre estas cargas, más polar es el compuesto. Esta polaridad complica su retención y separación con los métodos tradicionales de cromatografía en fase inversa, diseñados normalmente para compuestos no polares. 

Dado que los compuestos polares se atraen de forma natural debido a sus cargas opuestas, ¿cómo podemos hacer que un compuesto polar interactúe con una fase estacionaria no polar? Para ello hay que tener muy en cuenta las condiciones cromatográficas.  

Técnicas cromatográficas para el análisis de compuestos polares 

• Cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC): Consiste en una fase móvil polar, normalmente una mezcla de agua o agua tamponada combinada con más disolventes no polares como metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. La fase estacionaria es no polar y se crea uniendo una funcionalidad de hidrocarburo de cadena larga a un soporte de partículas de sílice, de núcleo sólido, polimérico o híbrido. Esta técnica funciona bien para compuestos no polares y requiere las herramientas adecuadas para manejar eficazmente analitos altamente polares. 
• Cromatografía de modo mixto: Aunque existen varios tipos de cromatografía de modo mixto (técnicas que utilizan múltiples mecanismos de separación para separar analitos de forma eficaz), la cromatografía de intercambio iónico de fase inversa se utiliza habitualmente para el análisis de analitos polares, incluida la purificación de proteínas, y combina mecanismos de fase inversa y de intercambio iónico para mejorar la retención de compuestos polares al tiempo que da cabida a analitos no polares. A diferencia de la cromatografía de intercambio iónico, que utiliza una fase estacionaria con grupos funcionales cargados negativamente para atraer y unir moléculas cargadas positivamente (cationes) de la muestra, la cromatografía de intercambio iónico de fase inversa combina la fase inversa y el intercambio iónico para mejorar la retención de compuestos polares sin dejar de dar cabida a analitos no polares.   
• Cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC): Técnica cromatográfica complementaria de la HPLC de fase inversa, la HILIC se utiliza para mejorar con éxito la retención de analitos muy polares. Una fase móvil rica en acetonitrilo y de bajo contenido acuoso junto con una fase estacionaria polar mejora esta retención, permitiendo que los analitos eluyan en orden creciente de hidrofilicidad o polaridad. 

Cada uno de estos enfoques es eficaz para el análisis de compuestos polares en determinadas condiciones, dependiendo de la polaridad y la carga de la muestra. Veámoslo más de cerca. 

Cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC): Obstáculos y soluciones 

La cromatografía líquida en fase inversa (RP-HPLC), utilizada habitualmente con columnas C18, suele emplearse para compuestos no polares y a menudo tiene dificultades con analitos muy polares, lo que dificulta la retención y la separación. Este método tiene varias limitaciones: 

• Retención inadecuada: Las columnas C18 pueden no retener eficazmente analitos muy polares. 
• Agentes emparejadores de iones: Estos agentes pueden mejorar la retención, pero a menudo requieren largos tiempos de equilibrio y pueden no ser compatibles con la espectrometría de masas (EM). 
• Mojado: Este fenómeno se produce cuando la fase móvil acuosa es expulsada de los poros no polares, provocando una pérdida de retención. 

Para satisfacer la mejora de la retención en RP-LC para analitos polares, Waters ha desarrollado tecnologías RP-HPLC mejoradas que optimizan la densidad del ligando y el tamaño del poro: 

• Columnas T3: Estas columnas presentan una menor densidad de ligando C18 y un mayor tamaño de poro, lo que reduce la humectación y mejora la retención de analitos polares. 
• CORTECS T3 Columnsconocidos por su tecnología de núcleo sólido, son compatibles con condiciones 100% acuosas y proporcionan una excelente forma de pico en un amplio intervalo de pH. 

Aumento de la selectividad y mejora de la retención con cromatografía de modo mixto 

La cromatografía de modo mixto proporciona una mayor flexibilidad en el desarrollo de métodos al permitir modificaciones en la composición de la fase móvil, incluidos el pH del tampón, la fuerza iónica y el contenido de disolvente orgánico. Sin embargo, las columnas de modo mixto tradicionales presentan varios retos: 

• Problemas de reproducibilidad: La variabilidad entre lotes puede dar lugar a una retención y separación incoherentes. 
• Adsorción inespecífica (NSA): se producen pérdidas de muestras debido a interacciones no deseadas entre los ácidos polares y la superficie de la columna, lo que reduce la recuperación y la precisión. 

Para superar estas limitaciones, Waters ha desarrollado tecnologías avanzadas de modo mixto que mejoran el rendimiento y la fiabilidad de las columnas, eliminando la necesidad de agentes de acoplamiento iónico, simplificando la preparación de la fase móvil y mejorando la compatibilidad de la EM. Además, el ajuste de la fuerza iónica de la fase móvil, el pH o la composición del disolvente orgánico permite mejorar la selectividad.  

Mejora de la compatibilidad LC-MS con la cromatografía HILIC 

HILIC mejora la retención y separación de analitos altamente polares utilizando una fase estacionaria polar y una fase móvil rica en acetonitrilo. Es ideal para azúcares, metabolitos, aminoácidos y pesticidas polares, donde los métodos de fase inversa pueden tener dificultades. Aunque el patrón de elución HILIC se asemeja al de la fase normal, utiliza un sistema de disolvente orgánico-acuoso de fase inversa que ayuda a superar algunos de los retos de la cromatografía de fase normal:   

• Solubilidad limitada del analito 
• Requisitos del sistema LC dedicado 
• Escasa reproducibilidad del ensayo 
• Compatibilidad limitada con EM por electrospray 

Para hacer frente a estos retos de la fase normal, Waters ha desarrollado tecnologías avanzadas que mejoran la retención, selectividad y reproducibilidad, al tiempo que aumentan la compatibilidad con las aplicaciones LC-MS.  

• HILIC: Al utilizar altas concentraciones de fase móvil orgánica (normalmente >80% de acetonitrilo), HILIC proporciona una forma óptima de los picos, una mayor sensibilidad y un mejor rendimiento de las especificaciones de masa. 
• Atlantis Premier BEH Z-HILIC Columns: Esta columna incorpora un ligando zwitteriónico de sulfobetaína, que proporciona una mayor retención y una selectividad única para compuestos polares. También incorpora Tecnología MaxPeak HPSy, lo que minimiza la NSA. 

Consideraciones clave para los cromatógrafos: Buenas prácticas para obtener resultados fiables  

Para obtener resultados cromatográficos coherentes y de alta calidad es necesario prestar atención a los detalles en la preparación y aplicación de los métodos. Estos consejos prácticos le ayudarán a optimizar la forma de los picos y la reproducibilidad en diferentes técnicas cromatográficas. 

• Preparación de la fase móvil: Utilizar tampones acuosos para formar una capa de agua estable sobre la fase estacionaria, crucial para HILIC. 
• Equilibrado de la columna: Deje tiempo suficiente para el equilibrado a fin de garantizar resultados reproducibles. HILIC puede requerir más tiempo que los métodos de fase inversa. 
• Diluyente de la muestra: Adapte el diluyente de la muestra a las condiciones iniciales de la fase móvil para mantener la forma y el área de los picos. Para HILIC, se recomienda una mezcla 75/25 de acetonitrilo y metanol para la mayoría de los analitos polares. 

Para retener y separar eficazmente los compuestos polares se requiere un profundo conocimiento de sus problemas específicos y la aplicación de técnicas cromatográficas avanzadas. Aprovechando las tecnologías de columna mejoradas y optimizando los métodos cromatográficos, puede lograr una mejor retención y separación de los analitos polares, lo que conduce a análisis más eficientes y precisos. 

Este blog presenta una visión general de alto nivel, pero nuestro seminario web a la carta ofrece una inmersión más profunda en cada técnica cromatográfica, equipándole con los detalles necesarios para perfeccionar su aplicación y obtener los mejores resultados. ¿No está seguro de qué columna es la adecuada para su compuesto polar? Consulte la Column Selection Guide for Polar Compounds. 

Recursos adicionales

• Column Selection Guide for Polar Compounds 
• Webinar sobre cómo superar los límites de la retención y separación de compuestos polares