Digestión enzimática: aceleración de las bioseparaciones con enzimas novedosas

El papel de las enzimas en el análisis LC-MS de los productos bioterapéuticos modernos 

Las enzimas son catalizadores naturales que permiten realizar transformaciones bioquímicas precisas y eficientes. En los flujos de trabajo analíticos, la digestión enzimática es una técnica fundamental para descomponer biomoléculas complejas en fragmentos más pequeños y manejables. Este proceso es crucial para aplicaciones como el mapeo de péptidos en la caracterización de proteínas y el mapeo de oligonucleótidos para terapias basadas en ARN. 

Los métodos de digestión tradicionales, aunque eficaces, suelen requerir largos tiempos de incubación e intervención manual, lo que crea cuellos de botella que ralentizan los plazos de desarrollo. Waters RapiZyme Enzymes Combina alta actividad y selectividad con protocolos de digestión optimizados que ofrecen mayor velocidad, reproducibilidad y escalabilidad para flujos de trabajo ópticos y LC-MS. 

Presentamos las enzimas Waters RapiZyme: potenciando los flujos de trabajo de digestión 

Las enzimas RapiZyme están diseñadas para ofrecer rapidez y consistencia, lo que permite flujos de trabajo de digestión que se adaptan a las exigencias analíticas modernas. El catálogo incluye: 

• RapiZyme Trypsin, para una digestión rápida y robusta de proteínas que facilite el mapeo de péptidos y los análisis proteómicos. 
• RapiZyme MC1 and Cusativin, Endonucleasas que permiten un mapeo más eficiente de oligonucleótidos (menos productos ambiguos, mayor cobertura de secuencias). 
• RapiZyme Proteinase K, que digiere completamente las proteínas en las biomatrices, lo que permite una mayor captura y recuperación de oligonucleótidos y otras moléculas unidas a proteínas, y también admite análisis del genoma/carga útil de vectores virales. 

Además, estas enzimas y protocolos de digestión se pueden automatizar fácilmente en la mayoría de las plataformas automatizadas de manipulación de líquidos, incluido el robot de pipeteo Andrew+ de Waters, lo que reduce el tiempo de manipulación manual y la variabilidad. 

Casos prácticos: Mapeo de péptidos con tripsina RapiZyme

Para la caracterización de proteínas, la digestión enzimática descompone las proteínas grandes en fragmentos peptídicos para su análisis mediante LC-MS. La tripsina es el método de referencia para el mapeo de péptidos debido a su escisión predecible en los residuos de lisina y arginina, lo que proporciona una alta cobertura de secuencias y reproducibilidad. Sin embargo, los protocolos de digestión convencionales pueden llevar horas y requieren múltiples pasos, lo que ralentiza el desarrollo biofarmacéutico. 

RapiZyme Trypsin aborda estos retos ofreciendo: 

• Protocolos de digestión rápida que reducen los tiempos de incubación de horas a minutos. 
• Alta cobertura de secuencia para anticuerpos monoclonales y otras proteínas terapéuticas. 
• Autólisis mínima que garantiza cromatogramas limpios y fáciles de analizar a partir de tripsina recombinante metilada de forma homogénea. 
• Compatibilidad con flujos de trabajo LC-MS para una caracterización optimizada. 

Estas características hacen que RapiZyme Trypsin sea ideal para entornos de alto rendimiento y flujos de trabajo que cumplen con las normativas. 

Casos prácticos: Mejora del mapeo de oligonucleótidos con RapiZyme MC1 y Cusativin

Para el análisis del ARNm, las endonucleasas RapiZyme MC1 y RapiZyme Cusativin permiten una digestión eficaz de secuencias de ARNm de cadena larga. Estas enzimas cortan el ARNm en sitios específicos, generando productos únicos y superpuestos que pueden mapearse para confirmar la secuencia y la ubicación de cualquier modificación de nucleótidos con confianza. A medida que las terapias basadas en el ARNm ganan terreno, las estrategias de digestión robustas siguen siendo esenciales para el control de calidad y el cumplimiento normativo. 

El mapeo de la secuencia del ARNm requiere un corte preciso y una señal fuerte. RapiZyme MC1 y Cusativin proporcionan: 

• Actividad endorribonucleasa novedosa y específica para la digestión del ARNm. 
• Intensidad de señal mejorada con productos fosfatados únicos. 
• Reproducibilidad constante de la escisión y la digestión para la confirmación de secuencias. 
• Protocolos preparados para la automatización en plataformas como Andrew+ Pipetting Robot. 
• Combinar con IonHance Hexafluoroisopropanol (HFIP) (disponible en 10 ml y 100 ml), aditivo de fase móvil para reducir a la mitad los aductos no deseados de sodio y potasio.  

Casos prácticos: Preparación fiable de muestras con RapiZyme Proteinase K 

Los oligonucleótidos terapéuticos suelen encontrarse en matrices biológicas complejas, como el tejido hepático o cerebral, lo que dificulta su extracción y análisis. La proteinasa K se utiliza ampliamente por su capacidad para degradar proteínas y liberar los oligonucleótidos unidos, lo que permite una extracción más eficaz, pero los protocolos tradicionales suelen ser lentos e inconsistentes. 

RapiZyme Proteinase K ofrece : 

• Digestión eficiente de proteínas en muestras de tejido para mejorar la recuperación de oligonucleótidos. 
• Compatibilidad con kits de microplacas SPE para optimizar los flujos de trabajo. 
• Mayor reproducibilidad para la extracción bioanalítica de terapias con oligonucleótidos (siRNA, ASO, etc.), incluidos los ASO conjugados con lípidos. 

En un recent application noteEl kit de microplacas SPE de OligoWorks, junto con el módulo de digestión RapiZyme Proteinase K, logró recuperaciones de analitos altamente reproducibles de ≥80 % para los oligonucleótidos GEM91 y GEM132, lo que demuestra la practicidad y escalabilidad del protocolo para que los laboratorios bioanalíticos puedan satisfacer las crecientes demandas del desarrollo terapéutico de oligonucleótidos. 

Al integrar la proteasa K RapiZyme en su flujo de trabajo, logrará una preparación de muestras más rápida y fiable para el bioanálisis de oligonucleótidos. 

Por qué la velocidad es importante en la digestión enzimática

Acelerar los flujos de trabajo de digestión se traduce en: 

• Plazos de desarrollo más rápidos para los productos biofarmacéuticos. 
• Mayor rendimiento en laboratorios de control de calidad y caracterización. 
• Reducción de la variabilidad mediante la automatización y la optimización de los protocolos. 

Waters desarrolló la gama de enzimas RapiZyme para simplificar los flujos de trabajo de digestión enzimática, ofreciendo soluciones rápidas, reproducibles y preparadas para la automatización para el análisis de proteínas y ARN. Pero esto es solo el principio. A medida que los investigadores adoptan estas enzimas y exploran nuevas aplicaciones, las posibilidades de acelerar el desarrollo biofarmacéutico siguen ampliándose, con un enfoque en la reducción de la complejidad. 

Tanto si realiza un mapeo de péptidos para anticuerpos monoclonales como un mapeo de oligonucleótidos para terapias basadas en ARNm, las enzimas RapiZyme ofrecen una forma rápida, fiable y reproducible de obtener resultados de alta calidad. No son solo reactivos, sino que representan un nuevo estándar de eficiencia en los flujos de trabajo analíticos. 

¿Listo para explorar las posibilidades que ofrecen las enzimas RapiZyme? Profundice en el tema con estos recursos: 

• RapiZyme Trypsin Infographic 
• Peptide Mapping eBook 
• Seminario web en línea de LCGC: Mapeo de péptidos para anticuerpos monoclonales 
• OligoWorks Infographic 
• RapiZyme Webpage Landing Page