分析法開発

カラムのスクリーニング

目的化合物をクロマトグラフィーで分離する前に、分析法の開発が必要です。分析法開発は、溶媒、時間およびサンプルを節約するために通常は分析スケールで実施されます。SFCでは混合物に含まれる単一成分のカラムケミストリーへの保持を予測することはできません。RPLCとは異なり、SFC分離では最適なカラムケミストリーを選択することが非常に重要であり、SFC分析法開発の最も重要な要素となります。したがって、精製のターゲットに関して分離の質を最大限にするための効率的なスクリーニング手法を実施することが重要です⁷。カラムケミストリーの開発は非常に活発に行われており、将来的にはより適したカラムとして少数のケミストリーが選択される可能性があります。現在、ほとんどの使用者は各自のアプリケーションに「最適」と思われるカラムを使用して自動化スクリーニングプロセスを実施しています⁷。

スクリーニングに適したカラム一式を選択するにはいくつかの要素を検討する必要があります。L/dp(長さ/粒子径)は、分析カラムと最終的に使用される分取カラムで同じに保つ必要があるため、適切なサイズの分析カラムのみを検討する必要があります。こうすることでスケールアップにおけるシステム間のクロマトグラフィーの連続性が確保されます。カラムは幅広い選択性を備え、サンプルの性質にも適していなければなりません。例えば、非常に極性の高い化合物(炭水化物など)はC₁₈カラムで保持するのは難しく、シリカカラムは非常に疎水性の高い(非極性)化合物(大部分のカロテノイドなど)には最適ではないと考えられます。カラムは塩基性化合物、酸性化合物またはその両方に対する適合性によっても分類されます。

キラル精製の場合はキラルカラムが必要です。カラムケミストリーと目的化合物との相互作用はより複雑になっているため、キラル分離に最適なカラムを選択するにはより多くの試行錯誤が必要となります。しかしながら、他のカラムよりもヒット率が高いカラムもあります。例えば、セルロースやアミロースをベースとするキラルカラムケミストリーは幅広い適用性の点でよく用いられ⁷、Pirkle型などその他のキラルカラムケミストリーは化学的安定性が高い点でよく使用されています。キラルカラムケミストリーはアキラルアプリケーションにも問題なく使用でき、特に位置異性体や類似化合物のアプリケーションで使用されます³。

カラムのスクリーニングは、通常、共溶媒が2~50%の間のグラジエント溶媒条件を使用して実施されます。これらの条件により、使用者はどのカラムが目的化合物の分離に最適となるかの有用な手掛かりが得られ、化合物の溶出に必要な共溶媒の割合の良い目安も得られます。図17は、(R)-および(S)-ゴイトリン(板蘭根に含まれる天然活性物質)のキラルカラムを用いたスクリーニング例です。5種類のセルロースおよびアミロースがベースのカラムケミストリー(IC、OJ-H、AS-H、OD-H、およびAD-H)および1種類のPirkle型カラムケミストリー(S,S)-Whelk-O1を使用しています¹⁶。図18に示すアキラルカラムのスクリーニング例では、3種類のカロテノイドの混合物を4種類のアキラルカラムケミストリーでスクリーニングしています¹⁷。

カロテノイドはC₁₈カラムで最も良好に保持されており、極性の高いその他のカラムケミストリーでは保持されないことが確認できます。

図17. キラルカラムを用いたスクリーニング例。6種類の固定相で分離した(R,S)-ゴイトリン標準物質のSFCクロマトグラム。グラジエント条件:10分間で5~40%、40%で2分間保持、1分間で40~5%、5%で2分間保持¹⁶。

図18.　アキラルカラムを用いたスクリーニング例。異なるカラムを用いたリコピン、ß-カロテン、およびルテイン混合物のUPC²UVクロマトグラム:(A)HSSC₁₈SB、(B)CSHFluoro-Phenyl、(C)BEH2-EP、および(D)BEH。各ピークの化合物名:1.リコピン、2.ß-カロテン、3.ルテイン。グラジエント条件:5分間で5~20%、20%で2分間保持、1分間で20~5%¹⁷。

溶媒のスクリーニング

一般的にCO₂だけでは化合物をカラムから溶出させるには不十分であるため、大抵は高極性の共溶媒が添加されます。共溶媒の選択は、SFCのクロマトグラフィー分析法開発と最適化における重要なパラメーターです。ほとんどのアプリケーションでは、幅広い共溶媒や混合溶媒を適用して分離を最適化できます。SFCにおいて適合性のある溶媒の範囲には圧倒されるように感じるかもしれませんが、極性スペクトルの両端、つまり、非極性CO₂と高極性の有機溶媒を組み合わせることでシンプルになります。その結果、幅広い範囲の溶媒強度に対応した移動相が得られます。

最も一般的に使用される共溶媒はメタノール、エタノール、2-プロパノールおよびアセトニトリルで、極性はメタノールが最も高く、アセトニトリルが最も低くなっています。通常、メタノールまたはエタノールがカラムのスクリーニング及び最初の溶媒スクリーニングに推奨されます。2-プロパノールとアセトニトリルは分析法の最適化の際、あるいはエタノールやメタノールでは十分な分離能が得られない場合に適しています。多くの場合、これらの溶媒を組み合わせることで移動相の極性を微調整できます。例えば、アセトニトリルをエタノールに添加することで共溶媒の強度が低くなるため、保持力が高まり、異なる選択性が得られます。通常共溶媒の強度が低下すると、保持力が高まります(図19)。また、LCと同様、強溶媒の割合が増加すると、保持力が低下します(図20)。場合によっては、CO₂の粘性が低いため、(共溶媒の割合は同じままで)全流量を増加させることで、結果、分離は維持したまま実行時間を短縮することが可能です(図21)。

図20. 保持力に対する共溶媒比率の影響

図21. クロマトグラフィーに対する全流量の影響

共溶媒に含まれる添加剤

分取クロマトグラフィーにおいてブロードなピークと低い溶解度は生産性を低下させる要因になるため、よりシャープなピークと高い分離能が重要です。SFCにおけるピークテーリングは移動相に含まれる共溶媒に添加剤を使用することで抑えることができ、その結果、CO₂ベースの移動相に適している溶質の範囲が拡大します¹⁰。

CO₂をクロマトグラフィー溶媒として利用する際、他の極性有機溶媒と組み合わせることでわずかに酸性の移動相となります。そのため、数多くの酸性化合物および中性化合物は、移動相の添加剤を必要とせずに許容可能なピーク形状が得られます。しかしながら、酸性添加剤によりピーク形状を改善できる酸性化合物もあります(図22)。一般的な酸性添加剤には、トリフルオロ酢酸(TFA)、ギ酸および酢酸があります。塩基性化合物を含むアプリケーションでは通常、クロマトグラフィーを改善するために塩基性添加剤(通常0.1~1%の範囲)が必要です(図23)。一般的な塩基性添加剤は、イソプロピルアミン(IPA)、ジエチルアミン(DEA)またはトリエチルアミン(TEA)などの二級アミンおよび三級アミンです。これらの添加剤は非常に低濃度(共溶媒中0.01%程度)であっても非常に効果的ですが、MS検出を妨害することがあり、カラムケミストリーによって、特に非修飾シリカの場合にはメモリー効果が確認される可能性もあります。そのため、カラムとMSにより負担が低く、MSシグナルの向上も可能な酢酸アンモニウムと水酸化アンモニウムも使用されています。

従来の共溶媒の他にも、多くの新しいカラムは、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルムまたはジメトキシメタンなどの従来以外の共溶媒や添加剤にも対応しています。これらを組み合わせることで、保持時間と選択性をさらに調節しながら、サンプル溶解度を向上させることができます⁷。従来以外の添加剤で普及してきている1つが水です。水はCO₂と混和しませんが、極性の高い共溶媒(メタノールなど)中で添加剤として使用すると、SFCにおいて親水性化合物の溶解度およびピーク形状を改善するのに最適な選択肢となります(図24)。許容される水の量は、移動相全体における共溶媒の割合により異なります。最終的には、移動相の相分離(非混和性)によりベースラインノイズが確認されるようになります¹⁰。一般的に、極性共溶媒中で効果的に使用できる水の量は1~5%です。水を添加剤として使用すると、より極性の高い化合物をSFC分取で精製することができます³。

精製目的の場合、除去する必要がある添加剤の使用は避けるべきです。分離に添加剤が必要な場合には、除去が簡単な揮発性の添加剤を最小有効濃度で使用します。別の方法として、現在、添加剤の必要性を一括して低減する新しいカラムケミストリーがあり、SFC分取に大きなメリットをもたらします。

図22. 酸性化合物のピーク形状および分離に対する酸性添加剤の影響

図23. 塩基性化合物のピーク形状および分離に対する塩基性添加剤の影響

密度: 温度および圧力

全ての化合物の溶解度および保持係数は、流体密度と密接に関連しています。移動相の物理的性質および化学的性質を制御する移動相密度はカラムと共に非常に重要です⁵。SFCの興味深い特性は、温度と圧力を使用して移動相の密度を制御できることです。カラムと移動相の選択はSFCにおける分離に非常に大きな影響を与えますが、温度と圧力は分離の微調整や、最適化に使用されます。これら2つのパラメーターでは、圧力の方がクロマトグラフィーに大きく影響します。圧力が上昇すると密度が上昇し、その結果、一般的には保持時間が早くなり、分離能が低下します(図25)。一方、温度が高いと密度が低下し、保持時間が長くなります。しかしながら、温度についてはその影響は化合物により異なり、分離能の変化、さらには溶出時間の近い化合物では溶出の順番が変化することがあります。このような現象はキラル分離でより多く確認されています(図26)。

圧力は、カラム以後のシステム「背圧」を設定する圧力調整器(BPR)を使用して制御されます。システムは幅広い圧力(最高設定値400bar)に対応するように設計されていますが、SFC分取では圧力調整器は通常100~200bar(1,450~2,901psi)の範囲で設定されます。温度はオーブン(カラムの加熱)または熱交換器(移動相の加熱)を使用して設定値により制御します。一般的な温度設定値は40~60°Cの範囲です。亜臨界(液体CO₂)条件で実行されるアプリケーションもあり、このような場合には温度は25~35°Cとより低い範囲に設定されますが、圧力は比較的高く保たれます。臨界点に近い圧力および温度では温度または圧力の小さな変化が密度(およびクロマトグラフィー)の大きな変化を引き起こすため、そのような条件で分析を実行することは推奨されません⁵。温度限界も圧力限界も一般的にカラムケミストリーまたはカラム充塡剤の頑健性と関連しています。

図25. 保持および分離能への圧力の影響

図26. 保持および分離能への温度の影響

移動相条件の最適化

溶媒とカラムの最適な組み合わせの選択は、アプリケーションまたは目的により異なります。完全なシナリオは、高い負荷量、良好な分離能および迅速な分離が組み合わさってターゲットを高純度で完全に分取することです。しかしながら、現実として最も生産的なソリューションを決定するためには取捨選択が必要になります。例えば、ピークは良好に分離できます(高い負荷量が可能)が、より長い実行時間が必要になる場合があります。一方、分離が良好で、実行時間が非常に短い場合、サイクル時間が短縮されることになりますが、負荷量が低下する可能性があります。別の検討事項としてはフラクションの分取、その後の処理があり、溶媒の量や種類が重要な要素となる可能性があります。最後に、分離をアイソクラティック条件で実施できる場合には、スタックインジェクションの利用が可能で、生産性が大幅に改善します。カラムと溶媒を選択したら、スケールアップおよび精製の前にその他のパラメーターを操作して分離をさらに最適化できます。

グラジエント条件の最適化:SFCではフォーカスグラジエントはRPLCと同じようには使用できません。順相クロマトグラフィーでは競合する保持メカニズムが多数あるため、グラジエントの変化は各分析種の保持に対して全く異なる影響を与えることになります。SFCでは特に、グラジエントにおける共溶媒の増加に伴う密度変化および圧力降下もあります。共溶媒の量が増えると、保持時間への影響が線形ではなくなるため、変化する条件で化合物の選択性を予測するのが難しくなります。構造類似化合物の場合は、保持メカニズムも類似するため、このことはあまり問題になりません。構造的に異なる(例えばマトリックス中で)化合物の混合物であるサンプルでは、より大きな課題となります。しかしながら、よりなだらかなグラジエント勾配の場合には保持時間が長くなり、分離能が向上します。図27は、図中に示される目的化合物に対するSFCにおけるフォーカスグラジエントの例です。

アイソクラティック条件の決定:アイソクラティック分析法は、スクリーニング結果に基づいて簡便に開発でき、さらにはスタックインジェクションの利用が可能になることから、生産性が高まるため理想的です。保持時間、スクリーニンググラジエントの傾き、およびシステムとカラムの遅延容量の補正を使用して、溶出時の共溶媒の割合を決定できます。SFCの最適な出発点は通常、算出された割合から5%を引いた値です。

図28の分離を例にとると、スクリーニンググラジエントは5分で2~20%およびグラジエント遅延は0.46分でした(事前に決定)。したがって、3.6%/minと算出された傾きおよび2%という出発割合を用いて、4.12分における最初のピークの溶出時の共溶媒の割合は以下の等式を用いて算出します:

• 溶出時の共溶媒の割合%=(保持時間–グラジエント遅延)×グラジエントの傾き+出発点の割合%
• 溶出時の共溶媒の割合%=(4.12分–0.46分)×3.6%/min+2%
• 溶出時の共溶媒の割合%=15%

したがって、5%を引いた10%のアイソクラティック共溶媒条件を最適化の出発点として使用しました。得られたクロマトグラフィーでは良好な分離が確認されましたが、移動相の共溶媒の割合を増加して15%に戻しても、ピークは短い実行時間で良好に分離されたままでした。この場合、10%では負荷量の増加が、15%ではサイクル時間の短縮が可能です。

分取システムの選択

システムのスケール

SFC分取では、さまざまなスケールでの分析に必要な要件を満たすために流量2mL/minから数百mL/minで使用できる装置が使用可能です7。適切なワークフローでは、精製のスケールがアプリケーションの目的と一致していなければなりません。このことはサンプルが少ない場合やサンプルの溶解度が低い場合、特に重要です。このような状況では、より小さなスケール、セミ分取システムが実用的です。SFCでは、小スケールの精製は通常内径が4.6mm~10mmのカラムを使用して、流量3~20mL/minで実施されます。SFC分取における流量および近似ローディングキャパシティに対応するカラムサイズの表を以下に示します(表7)。特定サンプルのローディングキャパシティは、溶解度、ターゲットの分離能、および目的化合物のマトリックスに対する相対量など多数の因子に左右されることに留意しなければなりません。

表7. カラム内径、流量および注入1回あたりの推定ローディングキャパシティ

SFC分取システムのスケールが大きくなると、内径が18mm~50mmのカラムを流量50~350mL/minの範囲で使用します。カラム容量が大きくなると、注入1回あたりの負荷量と流量を増やすことが可能になり、アプリケーションのスループットが最適化されます。精製分野では、これらのシステムは中規模と見なされます。大規模なパイロットスケールのSFC分取システム(本ガイドでは取り扱いません)は、確立された多くの工業プロセスで使用されています。そのようなプロセスでは、非常に大きな(内径30cm以上)高圧の動的軸圧縮(DAC)クロマトグラフィーカラムが使用され、一般的に工場設備として使用されます。

ワークフロー:「バルク」または「バッチ」

SFC分取にはアプリケーションに応じて2種類の基本的なワークフローがあります。1つは「バルク」精製と呼ばれます。このワークフローでは、ターゲットの目標量が分取されるまで、またはサンプルがなくなるまで、1種類のサンプルを複数回注入することで大量に処理します。該当する分取フラクションはすべて限られた数の分取ボトルの1つにプールされます。「バルク」量のサンプルが数時間(時には数日間)にわたり分取、処理されます。通常、UV検出を組み合わせた精製ですが、他の検出方法も利用できます。この場合、通常サンプルは既に特性解析され、十分に理解されており、高い生産性が目標となります。

多くの「バルク」アプリケーションでは、スタックインジェクションが使用されます。スタックインジェクションは、連続的な分離と精製のために使用可能なクロマトグラフィースペースをすべて利用することで、スループットを大幅に高めます。原則的に、スタックインジェクションは注入サイクル間の時間を短縮し、溶媒使用量をさらに削減します。スタックインジェクションの例を図29に示します。アプリケーションによっては、最初にインジェクションしたピーク全てが溶出される前に複数の注入を実施することもあります。スタックインジェクションを利用するには、分取中の注入が可能なシステムでなければなりません。したがって、独立した注入モジュールまたは分取アセンブリと注入アセンブリ(ニードルとプローブ)が独立して動くことが可能なシステムが使用されます。

図29. フルルビプロフェンのエナンチオマーのスタックインジェクションおよび分取

「バッチ」精製は、ライブラリー精製に最も実用的なワークフロー、または精製が必要なターゲットを複数含むサンプルが複数ある場合のワークフローを指します。通常は、フラクション分取時の選択性が高いことから、質量分析計を組み合わせた精製が使用されます。光学系(またはUV)検出を組み合わせた精製の場合、ピークを検出器で区別することができません。多くの化合物は同じ波長を吸収します。質量分析計を組み合わせた精製では質量情報に基づいてフラクションを分取します。多くの場合、質量情報は目的化合物とその他の不純物を区別できるため、非常に特異性の高いパラメーターです。このことは、特にサンプルに複雑なマトリックスが含まれる場合、サンプルの特性が十分に解明されていない場合、またはサンプルが発色団を持たないためUVで検出できない場合に有用です。通常、グラジエント法がピーク形状を改善し、化合物を複雑な干渉物質からより良好に分離するために使用されます。このワークフローでは、複数の容器を使用するオープンベッドでの分取を利用し、通常1本の容器が1つのフラクションとなります。サンプルは「バッチ」として実行され、目的化合物はその質量情報に基づき分取されます。バッチ精製はUVのみ、またはUVとMSのトリガーを使用して実施することもできます。MSを組み合わせた天然物からの目的化合物の精製の例を図30に示します。

図30. MSを使用した天然物からの目的化合物の精製:(A)五味子ベリー抽出物および(B)当帰根抽出物^18,19