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はじめに

精製とは品質低下、汚染、純度低下、または異物混入の原因となる物質を取り除くことです¹。化学分野では、物質中から各成分を分離し、不純物を除去することです。古来、人々は生活の質を高めるために化学物質を分離し精製する方法を使用してきました。創薬から化学工業、天然物、および食品の生産に至るあらゆる分野において精製は欠かせません。精製の目標は物質の分離、混合物組成の変更、または干渉物質の除去です²。具体的には精製をする理由は幅広く、一例として構造解析、活性研究、製品処方および濃縮、不純物プロファイリングなど数多くあります。精製という課題に対処するためにさまざまな複雑性と有効性を持つ数多くのソリューションがあります。しかしながら、ハイスループット環境における化合物の精製および分離は多くの場合、生産性のボトルネックとなっています。そのため、より高速でより効率的なツールが必要とされています³。超臨界流体を用いたテクノロジー(SFx)には精製ワークフローにおけるステップを効率化かつ単純化するために設計されたCO2を使用するさまざまな技術が含まれています。このようなSFxテクノロジーの1つが分取超臨界流体クロマトグラフィー(SFC分取)です。このビギナーズガイドでは、精製テクノロジーとしてのSFC分取の原理、アプリケーション、装置、およびワークフローをご紹介します。

 

SFxテクノロジーの紹介

超臨界流体テクノロジー(SFx) はSFCベースの精製を軸とする基本的概念です。ウォーターズのSFxテクノロジーには、抽出 (SFE)、分析クロマトグラフィー(UPC²®)、および分取クロマトグラフィー (SFC分取) があり、これらはすべて主溶媒として亜臨界CO2または超臨界CO2を利用します。液体の有機溶媒や水系溶媒の代わりにCO2を使用することで、SFxテクノロジーは液体ベースの精製に代わる補完性を持ちながら、費用対効果が高く、環境にも配慮された手法となりました。SFxは有機溶媒廃液が少なく、環境への負荷が少ないことから「環境にやさしい」テクノロジーと見なされています。LC精製と比較するとSFxテクノロジーはスピードと選択性が向上しているため、複雑な出発物質から最終生成物に到達するまでに必要な時間と費用が大幅に削減されます。装置テクノロジーの最近の進歩により、今では幅広い分野の精製アプリケーションにおいてSFxテクノロジーの分離能力が発揮されています。

 

溶媒としてのCO2

物質はその臨界圧力と臨界温度を上回ると超臨界流体になります。臨界点では、液相と気相の界面が消滅し、液体と同程度の密度を持つ高圧で圧縮された気体となります。また、超臨界流体は、気体と同程度の高い拡散性および低い粘性を示します。超臨界流体の溶媒和力は主に密度と関連しており、圧力と温度を操作することで調節できます。一般的に密度が高いということは溶媒和力が高いことを意味します4。密度の上昇は、温度の低下または圧力の上昇から生じます。一方で、温度の上昇と圧力の低下は密度の低下を生じます5。図1はCO2の相図です。ある状態から別の状態への物理的な変化および臨界点が表されています。


図1. CO2の相図。物理的状態変化および臨界点を表示



多くの物質は超臨界状態に達するために極端な条件を必要としたり、もしくは好ましくない性質を示します。表1は、各物質が超臨界流体になる条件とそれに伴う性質です。CO2は他の超臨界物質とは違い可燃性、爆発性、毒性、または腐食性がないため、基本的に安全だと考えられています³。CO2は31℃および74barと比較的緩やかな条件で超臨界状態に達することができるため、許容範囲内の温度と圧力で密度を操作することができます5。また、臨界温度が比較的穏やかであるため、熱に不安定なサンプルにも適しています。使用するCO2は他の工業プロセスから容易に回収されるため比較的安価です。これは環境中のCO2レベルに対する影響が中立的であることも意味します6。以上のすべてのメリットから、CO2は超臨界流体テクノロジーにおいて最も一般的に使用される物質となっています。

 

物質

臨界温度(ºC)

臨界圧力(bar)

性質

二酸化炭素

31

74

物理的状態を容易に調節可能

374

221

極端に高い温度・圧力が必要

 

メタノール

 

240

 

80

極端に高い温度が必要

アンモニア

132

111

腐食性が高い

フレオン

96

49

環境に有害

亜酸化窒素

37

73

酸化剤

n-ブタン

152

38

可燃性が高い

 

表1. 各物質の臨界温度・臨界圧力、および性質



SFxワークフローを用いた精製

精製のワークフローはアプリケーションの要件に基づいて、さまざまな複雑性および必要性を持つ複数のステップで構成されます。基本的なSFx精製のワークフローは以下の要素で構成されます(図2):

出発物質またはサンプル:サンプルは天然由来の植物のように複雑なものもあれば、特性が明らかな医薬品候補化合物のように比較的単純なものもあり、これに応じてサンプル調製の必要性や、精製スケールが決定されます。また、サンプルおよ極性、溶解度および反応性などサンプルの取り扱いを左右も役に立ちます。

サンプル調製:精製プロセスの最初のステップでは、出発物質の状態およびアプリケーションの目的や範囲に応じて、サンプルを適切に調製する必要があります。サンプル調製には、粉砕、乾燥、抽出、ろ過または単にサンプルを溶液に溶解させるなど、多くのステップが含まれることがあります。SFxワークフローでは、超臨界流体抽出 (SFE) が最初の(サンプル調製)ステップとなります。SFEは工業製品、バイオ植物、または天然物を取り扱うアプリケーションで一般的に使用されています。

サンプル精製:精製はサンプルの複雑性を低下させたり、分析や製品処方のために特定の純度仕様内で最終生成物を単離するために実施します。SFEで調製したサンプルは一般的に、目的の化合物と不純物が含まれる複雑な混合物です。SFxワークフローにおいて、分取超臨界流体クロマトグラフィー(SFC分取)は2番目のステップ(精製)であり、抽出物からは単一または複数の目的化合物を精製します。SFC分取はSFEだけでなく他の多くの方法で調製されたサンプルにも適用できます。

最終生成物:最終生成物はワークフローの最終目標です。最終生成物は、分析により得られたデータや情報、プロセスで使用される高純度物質、または直接利用できる生成物などです。最終生成物に応じて、ワークフローの成功に必要な装置および方法が決定されます。SFxワークフローでは、抽出(SFE)および精製(SFC分取)前後のサンプルの分析をUltraPerformanceコンバージェンスクロマトグラフィー(UPC2)を使用して実施します。

SFx以外のワークフローでは、これらのSFxテクノロジーのいずれかを調製、精製、または分析のステップとして必要に応じて利用できます。

 


図2. SFxワークフロー全体図



分取クロマトグラフィー:HPLCからSFCへの進化

分取液体クロマトグラフィー (HPLC分取) は、20 年以上にわたり精製で最も頻繁に使用される技術の 1 つとなっています⁶。特にファインケミカル、製薬およびバイオテクノロジー業界では製品の精製で幅広く使用されており、一般的な分離プロセスとなっています⁵。この間に、HPLC分取は特にアキラル精製のための非常に効率的で適用性の高い技術となりました。逆相液体クロマトグラフィー (RPLC) には、ユニバーサルなカラムケミストリー (C18) および一般的に水とアセトニトリルの混合移動相を使用しているというメリットがあります。RPLC質量分析 (MS) に対応しており、MS と組み合わせた RPLC (RPLC-MS) は多くの研究環境下において標準的な精製法となっています⁷。

HPLC分取はこのように広く使用されていますが、いくつかの欠点があります。化合物を精製するために必要な移動相の量は、処理されるサンプル全量よりも多くなります。一般的にHPLCで分取したフラクションには大量の溶媒(有機溶媒と水系溶媒の両方)が含まれ、溶媒除去して最終生成物を得るまでには時間とエネルギーを必要とし、生産性のボトルネックとなります。LC で使用される溶媒は、蒸発および曝露を介して局所的にも、化学廃棄物の燃焼を介して全体的にも環境汚染の原因になります。順相液体クロマトグラフィー(NPLC) は、一般的に移動相として 100% 有機溶媒が使用されるため、さらに環境に有害であると考えられています。このような環境要因があるため、LC で使用される溶媒の入手および廃棄にかかる費用はますます膨れ上がり、溶媒使用量の少ないプロセスまたは環境によりやさしいプロセスが求められる要因となっています⁵。SFC はこのボトルネックの軽減、時間短縮、溶媒廃棄量と費用を削減する業務改善の実現が可能な代替技術です⁸。近年、SFC 装置における進歩から、キラルとアキラル、両方の精製のための強力なツールとしてこの技術に新たな関心が寄せられています⁷。SFC はより環境にやさしい HPLC に代わる分析および精製法です6,3

 

SFCはクロマトグラフィーである!

超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)は亜臨界(液体)CO2および超臨界CO2を移動相の主溶媒とし、有機溶媒を混合するクロマトグラフィー技術です。あらゆるクロマトグラフィー法と同じく、SFCは固定相(カラム)と移動相(溶媒)との間の分析種の分配に基づいて成分を分離します5。HPLCとSFCには多くの類似点があります。例えば、SFCはアイソクラティック分析法とグラジエント分析法のいずれも実行でき、紫外線(UV)、フォトダイオードアレイ(PDA)、エバポレイト光散乱(ELS)、および質量分析計(MS)などの一般的な検出器すべてに対応しています。一般的なSFC分取ワークフローはHPLCのワークフローと同じく、分析法開発、スケールアップ、フラクション分取、分取したフラクションの純度分析で構成されます(図3)。また、回収率および純度に関してもRPLCに匹敵しており、SFCの方が回収率の高いアプリケーションもあれば、HPLCがより適したソリューションとなるアプリケーションもあります。7

 


図3. 分取クロマトグラフィーのワークフロー



SFCは通常、順相クロマトグラフィーの原理を利用しています。SFCがHPLCと違う点は、移動相の主成分としてヘキサンやヘプタンなどの非極性溶媒の代わりにCO2を使用していることです5。超臨界CO2は圧縮性流体であるため、圧力および温度が溶媒強度を制御するのに使用される重要なパラメーターとなり、保持および選択性に影響を与えます7,9。超臨界CO2は不燃性で毒性が極めて低く、高い拡散性と低い粘性、そして高い溶媒和力を持つため、分取クロマトグラフィーに適しています10。SFCは近年、溶媒の節約および生産性に関して大きなメリットをもたらすことから、精製を必要とするラボにとって魅力的なものとなっています。

SFC分取のメリット: 溶媒の節約

SFC分取の最大のメリットは、移動相の大部分をCO2に置き換えることによりもたらされる溶媒使用量の削減です6。このメリットは分析スケールでは小さなものであるかもしれませんが、分取スケールでは非常に重要です。数多くの精製ラボにおいて、分取したフラクションから溶媒を除去するために多大な時間が費やされており、化合物の精製を行ってから、目的の生成物や結果が得られるまでの間がボトルネックとなっています。SFC分取では、移動相に含まれるCO2は自然に除去されるため、少量の共溶媒のみが残ります。得られたフラクションでは濃度が高いため、溶媒除去と生成物の単離に必要な時間が短縮されます6。フラクションは、サンプル濃縮ステップを必要とせずに、直接分析することもできます。長時間にわたる乾燥濃縮条件下において容易に分解してしまう化合物の場合には特に重要です3

SFCで有機溶媒の使用量が少ないことは他にもコスト削減、可燃性および毒性に関する安全性、および環境への影響の軽減などのメリットがあります。溶媒の購入や廃棄に関してコスト面でかなりのメリットがありますが、溶媒除去に必要なエネルギー消費量が削減されることによる節約もあります7。また、SFCでは、RPLCで使用されるアセトニトリルやNPLCで使用される脂肪族炭化水素や塩素系溶剤などの毒性溶媒の使用を避けることもできます。溶媒としてのCO2は他の工業プロセスから得られる副産物であり、リサイクル可能であるため、比較的安価です。



SFC分取のメリット: 生産性の向上

SFCでは、移動相の粘性が低く、拡散性が高いため生産性が向上し、クロマトグラフィー速度と効率が向上します3。図4は、HPLC、UPLC®、SFC、およびUPC2のVanDeemter曲線の比較です。クロマトグラフィーでは、溶質が移動相中で拡散する速度11および固定相を出入りする速度によっても分離の速度が左右されます。SFCのVanDeemter曲線は、HPLCよりも幅が広く平坦ですが、これは流速(線速度)の上昇に伴いクロマトグラフィーの高い効率(低い理論段高)が保たれていることを示しています。SFCでは、拡散係数が高いことはクロマトグラフィー速度が高いことに直接つながります11


図4. HPLC、SFC、UPLC、およびUPC2のVan Deemter曲線



移動相の粘性が低いため、カラム圧とシステム圧が低くなり、HPLCの3倍から4倍の線速度が実現され、より小さな粒子径のカラムの使用が可能になります6,7。粘性が低いため平衡化時間も短縮されます。その結果、稼働時間が短く、分離効率が高くなり、ローディングキャパシティの増大および短い注入サイクル時間へとつながります。これらはあらゆる分取クロマトグラフィープロセスにおいて生産性を向上するための重要なパラメーターです。したがって、純度の高い化合物が短時間で得られ、全体的な生産性が高まります6,7。HPLCとSFC、それぞれにおける時間の節約および生産性の向上の例を表2にまとめました3

 

 

SFCによる精製

HPLCによる精製

分離時間

3時間

46時間

使用した有機溶媒量

メタノール 5L

アセトニトリル 40L

分取後の処理時間

1時間

8時間

回収率

95%

80%

 

表2. SFC分取とHPLC分取の比較(Merck & Co.提供)³



SFC分取は逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)と補完性がある

SFCとRPLCの相互補完関係により、多くのアプリケーションで製品の品質を改善する機会が得られます。RPLCではユニバーサルなソリューションとしてC18 カラムが使用され、分析法開発が大幅に簡易化されていますが、水系移動相では溶媒適合性と化合物溶解度の範囲が限られます。一方、SFCは幅広い有機溶媒を問題なく使用でき、溶媒と化合物との幅広い適合性が得られます。また、固定相にも幅広い選択肢があります。

SFCは、一般的には順相クロマトグラフィーと見なされ、使いやすいクロマトグラフィー手法においてさまざまな分離オプションを使用できるため、RPLCに対して補完性があります。特に、順相の選択性と高い分離効率を組み合わせることで、SFCは立体異性体、位置異性体、および構造類似体の化合物を分離する際に有利です5。非極性化合物の場合、SFCの柔軟性により逆相カラム(C18 など)の使用が可能となり、添加剤として水を使用することでアプリケーション範囲をより極性の高い領域まで拡大することができます10。分解しやすい化合物のアプリケーションでは、SFC精製は水を使用せず迅速に分離を行い、フラクションの乾燥濃縮が低温かつ短時間で実施されるため理想的な手法です。

SFC分取は回収率および純度に関してRPLCに匹敵し、SFCとRPLCの両方で実施できるアプリケーションもあります。図5は、医薬品化合物ライブラリーをSFCおよびLCによる精製に関してスクリーニングした研究の結果です。約82%の化合物はどちらの方法でも精製することができました12。同時に、この研究では2つのプラットホームが補完的であることも確認できます。SFCのみで精製が可能であった化合物(4%)もあれば、LCのみで精製が可能であった化合物(8%)もありました。これら2つのプラットホームを組み合わせることで得られる柔軟性により、分離と精製を最適化する機会が増えます。SFCはRPLCに補完的な選択性を提供し、分析法開発および難易度の高い複雑なサンプルの分離において補完性のあるアプローチを実現します8。2つのプラットホームでマルチステップ精製を実施したり、フラクション分析のために補完性のある手法を使用することで、より純度の高い化合物を分取し、より多くの情報を得ることができます。補完性のあるLC分離およびSFC分離を用いた複雑なマトリックスからの化合物の精製例を図6に示します。

 


図5. SFC分取およびLC分取を用いてスクリーニングした化合物に関するサンプル精製の成功率12

 

 


図6. LC(ステップ1)およびSFC(ステップ2)による補完性のある2段階精製を使用した天然抽出物からのターゲット化合物精製の例

 

 

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