逆相クロマトグラフィ
逆相クロマトグラフィは、今日ラボで使用されている液体クロマトグラフィの分離モ－ドの中で最も多く使用されている手法で、それは、ウォーターズ逆相カラム製品の品ぞろえの多さにも反映されています。
逆相クロマトグラフィは、通常水またはバッファとメタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの極性有機溶媒が混合された極性移動相、およびシリカまたはハイブリッド担体に結合した長鎖炭化水素などの非極性固定相で構成されています。近年の研究開発の労力の多くは、カラム効率とpH安定性を向上させ、新たな選択性を提供することを目的として、カラム充てん剤の分野に費やされてきました。
ウォーターズの最新逆相カラムは、以下の3つのカテゴリに分類できます。
- ハイブリッド – 柔軟性のあるメソッド開発オプションを提供するために、pH安定性を最大にするようにデザインされています。XBridge™、ACQUITY® BEH、およびXTerra®ブランドで使用できます。使用pH範囲は1～12です。
- シリカ – 歴史的に、最も一般的に使用されている逆相担体です。SunFire™およびSymmetry®製品は、ウォーターズTaunton工場で原料から合成されており、ローダビリティを最高にするようにデザインされています。使用pH範囲は2～7です。
- 特定アプリケーション用 – 高極性分子の保持を向上させるためのAtlantis®カラムなど特定のアプリケーション分野をターゲットとして設計されています。
順相クロマトグラフィ
逆相の結合相が開発されるまでは、順相クロマトグラフィが最も一般的な分離手法でした。これは、分析種と固定相表面にある極性官能基の相互作用に頼っており、この相互作用は、移動相として非極性溶媒を使用する場合に最も強くなります。
入手可能な広範な溶媒を分離の選択性の調整に使用できるため、順相クロマトグラフィは強力な分離ツールです。ただし、使用上の難しさにより、多くのクロマトグラフィ分析担当者に不評でした。ある状況下では、長い平衡化時間や再現性の問題が発生する場合があります。そのほとんどは、移動相内に混入した微量の極性成分（例えば水分）の影響によるものです。これらの問題を解決すると、一般的に使用する溶媒の粘度が低いため、通常は逆相メソッドよりも優れたクロマトグラムが得られます。
順相カラムは、SunFire、Nova-Pak、およびSpherisorbブランドにおいて用意されています。
HILIC (親水性相互作用クロマトグラフィ)
親水性相互作用クロマトグラフィは従来から実施されてきましたが、HILICという言葉は最近になって一般的に使用されるようになりました。分析種は、極性代謝物、炭水化物、ペプチド類などの高極性成分に適しています。
HILICは、順相クロマトグラフィを水系移動相の領域に拡張したものと考えることができます。移動相は水またはバッファ(< 40%)と有機溶媒の混合液です。固定相は、シリカ、極性結合相、極性ポリマー充填剤、イオン交換体などの高親水性極性吸着剤です。これらの固定相のすべてに共通する性質は容易に水和することです。
HILICモードで使用するグラジエントメソッドは、逆相モードのメソッドとは正反対になります。初期条件は通常は95%前後の高有機溶媒混合比となっており、時間と共に水混合比の高い方向へ徐々に変化します。そのため逆逆相という呼び方も一般的になってきています。
この手法の使用率の上昇と共に、新しいHILIC充てん剤の開発が増加しています。
Waters HILICカラムは現在、Atlantis®、XBridge™、およびACQUITY®製品ファミリで入手できます。
イオン交換クロマトグラフィ
イオン交換クロマトグラフィでは、タンパク質表面の電荷と充てん剤表面のイオン交換基の電荷の相互作用により分離が行われます。イオン交換で保持するためにはタンパク質と充てん剤の電荷が正反対である必要があります。バッファのpH、バッファの組成、グラジエントの傾き、グラジエントに使用する塩の種類などの変更可能なパラメータによって、分離を最適化することができます。
サイズ排除クロマトグラフィ
溶液中の生体分子の見かけの大きさと形状は、サイズ排除クロマトグラフィの分離の基準になります。この単純な分離メカニズムは、サンプル重量や容量など以外に、生体分子の大きさの違い、充てん剤の素材、ポアサイズ、および粒径に依存しています。最新のサイズ排除充てん剤素材は、従来の多糖類ソフトゲルから、より高分離能および超高速分離を提供する小さく硬い素材になりました。
サイズ排除には、タンパク質単離に関して幅広い応用性があります。分析時間が比較的短く、手法が比較的簡単であることから、フラクションの評価に使用されることがあります。また、分子量が低い塩類はそれよりもかなり大きいタンパク質から容易に分離するので、バッファの交換にも使用できます。
アフィニティクロマトグラフィ
アフィニティクロマトグラフィは、固定化リガンドと生体成分(モノクローナル抗体や組み換えタンパク質)とが生体固有の相互作用に基づいて単離されるクロマトグラフィモードです。生体分子は、生物活性により高回収率、高純度で精製することができます。現在のアフィニティ充てん剤には、機械強度の高い硬質素材が使用され、その高いベッド安定性からμgからgオーダーのハイスループットアフィニティ精製を可能にします。多くの分離が1つの手順で実現できるため、費用効率が高い手法です。
疎水性相互作用クロマトグラフィ
このクロマトグラフィモードは、高イオン強度で疎水性表面にタンパク質を結合させる手法で、タンパク質精製で広範囲に使用されます。タンパク質は、移動相イオン強度を減少させるグラジエントで溶出されます。疎水性相互作用クロマトグラフィは、通常タンパク質の活性を維持した状態で良好な分離能を与えます。移動相には水系バッファを使用します。バッファ塩の濃度と種類、バッファpH、界面活性剤、添加剤、カラム温度、固定相官能基など、多くのさまざまな要因が分離能に影響を与えます。タンパク質は高イオン強度条件下で互いに作用しあっているので、精製開始時にサンプルが既に部分的に精製されていれば、よい分離が得られます。また、多量のサンプルを高イオン強度下で大容量にロードするのは適当ではありません。以上の特性より、疎水性相互作用クロマトグラフィの前に硫安沈澱を行うなど、分離手順の中でも2番目以降の手順として使用するのが適切といえます。
