Variazioni Della Forma Del Picco Con Maggiore Volume Di Iniezione

Come indicato in questa serie, le variazioni nella forma del picco sono un problema comune nelle analisi HPLC. Teoricamente, i picchi dovrebbero essere simmetrici, con una forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362]. La simmetria di un picco può essere quantificata calcolando il fattore di scodamento USP (T), come illustrato nella Figura 1. Un fattore di scodamento pari a 1 indica una simmetria perfetta, mentre valori inferiori a 1 sono indicati come fronting (fronte) e valori maggiori di 1 come scodamento. Molti metodi richiedono che i fattori di scodamento di tutti i picchi rientrino in un limite specificato. I fattori di scodamento che si discostano in modo significativo da 1 possono ridurre la risoluzione dei picchi che eluiscono ravvicinati uno all’altro rendendo più difficile l’integrazione [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362]. Inoltre, quando la simmetria del picco è insufficiente, spesso il picco è più ampio del dovuto, il che riduce l’altezza del picco. Nelle applicazioni che comportano la rivelazione e la quantificazione di analiti presenti a basse concentrazioni, ciò può ridurre la precisione dei risultati, nonché i limiti di quantificazione e rivelazione.

Un passaggio importante nello sviluppo di metodi per la quantificazione di analiti presenti a basse concentrazioni è l’ottimizzazione del volume di iniezione. Teoricamente, le aree e le altezze dei picchi incrementano in modo lineare con il volume di iniezione per una composizione fissa del campione fino a quando non inizia a verificarsi un sovraccarico della massa, del volume o del rivelatore [U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997, pp. 355-356]. Nell’esempio mostrato nella Figura 2A una miscela di sei analiti, ciascuno a una concentrazione di 0,2 µg/mL, è stata separata utilizzando un gradiente di acetonitrile del 5%-95%. Il volume di iniezione era di 2 µL ed è stata utilizzata una colonna da 2,1 x 50 mm, quindi il volume di iniezione era pari all’1,1% del volume della colonna. Poiché le linee guida generali prevedono che il volume di iniezione sia pari all’1%-10% del volume della colonna [Waters Knowledge Base 48961], sembrava esserci spazio per incrementare il volume di iniezione allo scopo di incrementare i rapporti segnale-rumore. Quando il volume di iniezione è stato aumentato a 4 µL, si è ottenuto il cromatogramma mostrato nella Figura 2B. Mentre le aree di tutti e sei i picchi sono incrementate di un fattore pari a due, come previsto, i primi due picchi non sono aumentati in altezza, ma sono diventati più ampi con un fronting pronunciato.

Come indicato nelle prime due parti, sono diverse le cause che possono portare a variazioni della simmetria del picco, tra cui problemi relativi al sistema HPLC, alla fase mobile, al campione e alla colonna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Come indicato in precedenza, un buon punto di partenza per la risoluzione dei problemi consiste nell’analizzare attentamente i cromatogrammi per osservare se la variazione nella forma del picco è visibile per tutti i picchi o solo per alcuni di essi. Quando solo alcuni picchi di un cromatogramma mostrano picchi di fronting, come nella Figura 2B, le possibili cause includono la coeluizione di un composto interferente, il sovraccarico di massa e l’uso di un solvente del campione troppo forte. Poiché il problema è stato osservato dopo l’incremento del volume di iniezione e con basse concentrazioni di analita, quest’ultima causa sembra essere la più probabile. Il solvente del campione utilizzato per i cromatogrammi mostrati nelle Figure 2A e 2B era 50/50 v/v acetonitrile/acqua; è stato scelto perché alcuni analiti hanno una solubilità limitata in acqua. Poiché il gradiente inizia con una concentrazione di acetonitrile pari soltanto al 5%, il solvente del campione è notevolmente più forte rispetto alla fase mobile iniziale. Poiché i primi analiti a eluire sono i meno idrofobici, sono maggiormente interessati dal solvente forte del campione. Per verificare questa ipotesi, è stata preparata una serie di campioni con le stesse concentrazioni di analita, ma con rapporti diversi tra acetonitrile e acqua. I risultati del fattore di scodamento per i primi due picchi vengono mostrati nella Figura 3. I fattori di scodamento per entrambi gli analiti diminuiscono all’aumentare della concentrazione di acetonitrile, a dimostrazione del fatto che l’uso di un solvente forte del campione è la causa dei picchi di fronting mostrati nella Figura 2B. Per evitare questo problema, pur garantendo la dissoluzione degli analiti maggiormente idrofobici, è stata scelta una concentrazione di acetonitrile pari al 10%. Nella Figura 2C viene mostrato il cromatogramma risultante dall’iniezione di 4 µL di un campione disciolto in 10/90 v/v acetonitrile/acqua. Ora tutti i picchi mostrano l’incremento in altezza previsto del doppio rispetto all’iniezione da 2 µL, con una buona simmetria del picco. Quando si ottimizza il volume di iniezione, tenere sempre in considerazione la forza del solvente del campione rispetto alla composizione iniziale della fase mobile.