La Forma del Picco Cambia nel Tempo

Come discusso nelle prime tre parti di questa serie, i problemi di forma del picco sono tra i più comuni nelle analisi HPLC. Teoricamente, i picchi dovrebbero essere simmetrici, con una forma gaussiana [D.R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353-362]. La simmetria di un picco può essere quantificata calcolando il fattore di scodamento USP (T), come illustrato nella Figura 1. Un fattore di scodamento pari a 1 indica una simmetria perfetta, mentre valori inferiori a 1 sono indicati come fronting (fronte) e valori maggiori di 1 come scodamento. Molti metodi richiedono che i fattori di scodamento di tutti i picchi rientrino in un limite specificato. I fattori di scodamento che si discostano in modo significativo da 1 possono ridurre la risoluzione dei picchi che eluiscono ravvicinati uno all’altro rendendo più difficile l’integrazione [D.R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353-362]. Inoltre, quando la symmetry del picco è insufficiente, in genere il picco è più ampio del dovuto, il che riduce l’altezza del picco. Nelle applicazioni che comportano la rivelazione e la quantificazione di analiti presenti a basse concentrazioni, ciò può ridurre la precisione dei risultati, nonché i limiti di quantificazione e rivelazione.

In molte applicazioni un metodo viene utilizzato ripetutamente per analizzare un gruppo di campioni. Per garantire risultati accurati, è importante che la colonna fornisca ampiezze dei picchi e fattori di scodamento coerenti per la durata della serie di analisi. Tuttavia, ciò potrebbe non essere sempre possibile nella pratica. Nell’esempio mostrato nella Figura 2, una separazione isocratica di quattro composti ha mostrato variazioni nell’ampiezza dei picchi e nella symmetry dei picchi dopo 100 iniezioni. È stata utilizzata una colonna C₁₈-silica con una fase mobile contenente un tampone fosfato di potassio a pH 7,0 e metanolo (35:65 v/v) e una temperatura della colonna di 40 °C. Come discusso nelle prime tre parti, le possibili cause di modifica della symmetry dei picchi sono diverse, inclusi problemi con il sistema HPLC, la fase mobile, il campione e la colonna [J.W. Dolan e L.R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pagg. 385-420]. Come indicato in precedenza, un buon punto di partenza per la risoluzione dei problemi consiste nell’analizzare attentamente i cromatogrammi per osservare se la variazione nella forma del picco è visibile per tutti i picchi o solo per alcuni di essi. Nei cromatogrammi mostrati nella Figura 2, la variazione maggiore si osserva per la nortriptilina (picco 1), mentre una variazione minore si osserva per l'amitriptilina (picco 4). Per questi due picchi sono evidenti anche aumenti significativi del tempo di ritenzione. Gli altri due picchi (picco 2, 2-metilnaftalene; picco 3, acenaftene) mostrano variazioni minori. In particolare, nortriptilina e amitriptilina sono composti basici, mentre 2-metilnaftalene e acenaftene non sono ionizzabili. Quando solo i picchi dei composti basici mostrano un aumento dello scodamento e dei tempi di ritenzione, come nella Figura 2B, le cause probabili includono una variazione nella fase mobile o nella colonna. Per determinare quale di questi fattori ha causato le modifiche osservate nel cromatogramma nella Figura 2B, la colonna è stata sostituita con una nuova colonna dello stesso tipo. Utilizzando la stessa fase mobile, è stato ottenuto il cromatogramma mostrato nella Figura 2C. Questo cromatogramma mostra una separazione simile a quella ottenuta inizialmente sulla colonna originale, a indicare che la causa dell’aumento dello scodamento all’iniezione 100 era una modifica nella colonna.

Poiché la colonna è stata utilizzata entro gli intervalli consigliati di temperatura (20-45 °C) e di pH (2-8), questo deterioramento relativamente rapido non era previsto. Tuttavia, è importante considerare che il pH del tampone acquoso cambia quando viene aggiunto il solvente organico (metanolo). È stato segnalato che la diluizione di una soluzione acquosa di fosfato a pH 7,05 con un volume uguale di metanolo provoca un aumento del pH a 8,29 [I. Canals, J.A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal. Chem. 72 (2000) 1802-1809]. Poiché la fase mobile utilizzata per produrre i cromatogrammi della Figura 2 contiene il 65% di metanolo, ci si aspetterebbe che il pH della fase mobile sia ancora più alto e superiore al limite consigliato di 8. L’utilizzo di una fase mobile con pH superiore al limite consigliato può portare all’idrolisi della fase stazionaria, con conseguente perdita di gruppi legati e formazione di silanoli aggiuntivi, nonché una perdita di efficienza [J.J. Kirkland, M.A. van Straten, H.A. Claessens, J. Cromatogr. A 691 (1995) 3-19]. Questo è probabilmente il motivo delle modifiche nella forma del picco e nella ritenzione mostrate nella Figura 2B.

Quando si utilizzano fasi mobili con un pH superiore a 8, una soluzione più robusta rispetto a una colonna in C₁₈-silica è una colonna impaccata con particelle ibride organiche-inorganiche [K.D. Wyndham, J.E. O’Gara, T.H. Walter, K.H. Glose, N.L. Lawrence, B.A. Alden, G.S. Izzo, C.J. Hudalla, P.C. Iraneta, Anal. Chem. 75 (2003) 6781-6788]. A tale scopo, lo stesso metodo è stato utilizzato con una colonna a particelle ibride (XBridge BEH C₁₈), ottenendo i risultati mostrati nella Figura 3. Grazie alla migliore stabilità alcalina della colonna a particelle ibride, non sono state osservate variazioni significative nella forma dei picchi nell’arco di 120 iniezioni. Questi risultati mostrano che le variazioni della forma dei picchi nel tempo possono essere causate dall’idrolisi della fase legata, in particolare quando si utilizza una colonna in prossimità dei limiti di pH e temperatura consigliati. È importante tenere in considerazione l’effetto del solvente organico sul pH del tampone acquoso quando si controlla se il pH della fase mobile rientra nell’intervallo consigliato per la colonna.