Variazioni Alla Forma Del Picco Per Una Colonna Utilizzata In Precedenza

Come indicato in questa serie, le variazioni nella forma del picco sono un problema comune nelle analisi HPLC. Teoricamente, i picchi dovrebbero essere simmetrici, con una forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362]. La simmetria di un picco può essere quantificata calcolando il fattore di scodamento USP (T), come illustrato nella Figura 1. Un fattore di scodamento pari a 1 indica una simmetria perfetta, mentre valori inferiori a 1 sono indicati come fronting (fronte) e valori maggiori di 1 come scodamento. Molti metodi richiedono che i fattori di scodamento di tutti i picchi rientrino in un limite specificato. I fattori di scodamento che si discostano in modo significativo da 1 possono ridurre la risoluzione dei picchi che eluiscono ravvicinati uno all’altro rendendo più difficile l’integrazione [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362].

Quando si esegue la configurazione per eseguire un metodo stabilito su una colonna utilizzata in precedenza, è necessario eseguire un test di adeguatezza per verificare se la colonna è in buone condizioni. Questo test deve valutare la capacità della colonna e del sistema di produrre pressione, tempi di ritenzione, aree dei picchi, ampiezze dei picchi e simmetria del picco accettabili. Una variazione significativa in una qualsiasi di queste risposte rispetto ai risultati ottenuti in precedenza sulla colonna potrebbe indicare un problema della colonna. Nella Figura 2 viene mostrato un esempio in cui si utilizza il materiale di riferimento per il controllo di QC in fase inversa Waters (codice: 186006363). Questo materiale di riferimento, che contiene sette composti, è stato analizzato utilizzando un metodo a gradiente. Inizialmente (Figura 2A), i fattori di scodamento USP erano compresi tra 0,90 e 1,27, in un intervallo accettabile. Dopo che la colonna è stata rimossa dal sistema e successivamente ricollegata, è stato eseguito lo stesso metodo di test, ottenendo il cromatogramma mostrato nella Figura 2B. Mentre i tempi di ritenzione, le aree dei picchi e la pressione della colonna erano simili ai risultati iniziali, i fattori di scodamento USP per tutti e sette i picchi erano più elevati, con valori compresi tra 1,32 e 1,65.

Come indicato nella parte 1, sono diverse le cause che possono portare a variazioni della simmetria del picco, tra cui problemi relativi al sistema HPLC, alla fase mobile, al campione e alla colonna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Come indicato in precedenza, un buon punto di partenza per la risoluzione dei problemi consiste nell’analizzare attentamente i cromatogrammi per osservare se la variazione nella forma del picco è visibile per tutti i picchi o solo per alcuni di essi. Quando tutti i picchi di un cromatogramma mostrano variazioni di forma del picco simili, come nella Figura 2B, le cause possibili includono la presenza di un vuoto nella colonna, l’accumulo di componenti della matrice del campione nella colonna o uno scarso collegamento della colonna al sistema HPLC. Poiché il problema non era stato riscontrato durante l’utilizzo precedente della colonna, è improbabile che la colonna presentasse un vuoto o un accumulo di matrice del campione. Come causa più probabile, rimane uno scarso collegamento al sistema HPLC. I collegamenti della colonna sono stati riposizionati e il metodo di test di adeguatezza è stato eseguito nuovamente. Come mostrato nella Figura 2C, i fattori di scodamento USP sono stati ripristinati sui valori iniziali. Ciò conferma che il problema era causato da un collegamento errato della colonna, che ha creato uno spazio tra la colonna e il tubo che la collega al sistema (vedere la Figura 3). Anche uno spazio minimo è sufficiente a causare una deformazione della forma del picco. Per la dimostrazione su come collegare colonne con diversi tipi di raccordi terminali ai vari sistemi HPLC, vedere la serie di video presenti a questo URL: How to Connect HPLC Columns to Waters LC Systems (Come Collegare le Colonne HPLC ai Sistemi LC Waters)