Risoluzione dei Problemi Relativi Alla Forma Del Picco In HPLC

Un problema comune nelle analisi HPLC è la variazione della forma del picco. Teoricamente, i picchi dovrebbero essere simmetrici, con una forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362]. La simmetria di un picco può essere quantificata calcolando il fattore di scodamento USP (T), come illustrato nella Figura 1. Un fattore di scodamento pari a 1 indica una simmetria perfetta, mentre valori inferiori a 1 sono indicati come fronte e valori maggiori di 1 come scodamento. Molti metodi stabiliscono il requisito secondo il quale i fattori di scodamento di tutti i picchi devono essere inferiori a un limite specificato. Fattori di scodamento più elevati possono ridurre la risoluzione dei picchi che eluiscono ravvicinati uno all’altro rendendo più difficile l’integrazione [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362].

Quando si utilizza un metodo consolidato per analizzare un lotto di campioni, a volte la forma del picco può variare nel corso di una serie di iniezioni. In questo caso i fattori di scodamento potrebbero non soddisfare il requisito. Sono diverse le cause che possono portare a questo problema, tra cui problemi relativi al sistema HPLC, alla fase mobile, al campione e alla colonna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Durante la risoluzione dei problemi, un buon punto di partenza è analizzare attentamente i cromatogrammi per osservare se la variazione nella forma del picco è visibile per tutti i picchi o solo per alcuni di essi. In quest’ultimo caso, esaminare le proprietà degli analiti che mostrano picchi variati e determinare in che modo differiscono da quelle degli analiti con picchi invariati. Gli analiti problematici sono basici o acidi, mentre gli altri non lo sono? In tal caso, la causa potrebbe essere una variazione della carica superficiale della fase stazionaria o una variazione di pH della fase mobile. Se gli analiti che mostrano la variazione della forma del picco sono basici mentre gli altri non lo sono, una probabile causa principale per i metodi in fase inversa è la perdita di gruppi di end-capping dalla fase stazionaria, che incrementa la concentrazione di gruppi silanolici. I gruppi silanolici ionizzati sulla particella di base sono una causa comune di scodamento del picco per gli analiti di base [D. V. McCalley, Chem. Comm. 59 (2023), pp. 7887-7899].

Nel caso in cui tutti i picchi in un cromatogramma presentino variazioni simili della forma del picco, una possibile causa potrebbe essere lo slittamento del tubo di collegamento tra la colonna e il sistema HPLC. Ciò può verificarsi quando si utilizzano raccordi in PEEK serrati a mano. Un’altra possibile causa è la presenza di un vuoto nella colonna, che può verificarsi quando una colonna viene esposta a rapide variazioni di pressione o viene utilizzata in condizioni di pH e/o temperatura che provocano l’idrolisi delle particelle di supporto della fase stazionaria. Capita spesso quando si utilizzano colonne a base di silice con fasi mobili basiche (pH >7), in particolare a temperature elevate (>30 °C) [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995), pp. 3-19., H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr. A 728 (1996), pp. 259-270]. Una terza causa potenziale è l’accumulo di componenti della matrice del campione nel sistema HPLC e/o nella colonna. Molti campioni contengono componenti che possono precipitare o essere soggetti a forte adsorbimento sulle superfici del sistema e della colonna, come proteine, lipidi, polisaccaridi e tensioattivi. Quando questi componenti si accumulano sulle superfici del sistema e/o della colonna, possono interrompere la distribuzione del flusso, con conseguente variazione della forma di tutti i picchi.

Prendere in considerazione i cromatogrammi mostrati nella Figura 2. Il cromatogramma iniziale mostra cinque picchi con buoni fattori di scodamento, compresi tra 1,01 e 1,09. Dopo 200 iniezioni campione, il cromatogramma ora mostra che tutti e cinque i picchi hanno maggiori fattori di scodamento compresi tra 1,61 e 1,97. La contro-pressione della colonna ha mostrato solo un lieve incremento (3,5%) nel corso delle 200 iniezioni.

Gli analiti sono tutti neutri nelle condizioni di separazione, quindi una variazione della concentrazione del gruppo silanolico sulla superficie della fase stazionaria non può essere la causa dei picchi di scodamento. La fase mobile conteneva solo acqua e acetonitrile e la temperatura della colonna era di 40 °C, quindi lo svuotamento della colonna non è probabile. Che dire dell’accumulo di componenti della matrice del campione nella colonna? I campioni contenevano proteine, nonché grassi e zuccheri. La colonna utilizzata per questo esempio era dotata di una pre- colonna integrata rimovibile. Quando la pre-colonna è stata sostituita con una nuova, i fattori di scodamento per tutti e cinque i componenti sono stati ripristinati su valori prossimi a 1, come mostrato nel cromatogramma in basso. Ciò conferma che lo scodamento del picco è stato causato dall’accumulo di componenti della matrice del campione nella pre-colonna. Quando si lavora con campioni che contengono componenti della matrice che possono precipitare o essere soggetti a forte adsorbimento sulla colonna, l’utilizzo di una pre-colonna può essere un modo relativamente economico per massimizzare la durata di una colonna. Come mostrato in questo esempio, si tratta anche di uno strumento utile per identificare la causa principale dei problemi legati alla forma del picco.