生物偶联物通过靶向分子设计实现强效载荷的精准递送,在新一代治疗药物中发挥着越来越重要的作用。要优化这类复杂且异质的分子,需要借助强大的分析技术来全面表征其关键属性,例如偶联位点、有效载荷分布以及整体分子异质性。
随着生物偶联分子从发现阶段推进到商业化阶段,其结构的多样性和复杂性带来了巨大的分析挑战。全面表征对于确保其安全性、有效性及稳定的产品质量至关重要。
沃特世提供专用的解决方案,助您深入洞察生物偶联物的结构与质量。无论您的生物偶联物结构如何,我们的方案都能助您简化复杂分子的分析流程,并加速对关键质量属性的表征与监测。
案例研究:沃特世如何助力新型疗法的开发
生物制药工作流程专用的waters_connect采用专为生物偶联物分析量身定制的工作流程,集成了偶联比和分布的自动计算功能,可加快从样品分析到决策制定的过程。
Waters Protein-Pak高分离度疏水作用(HIC) HPLC色谱柱可实现高质量的LC分析,测定半胱氨酸偶联ADC和高度疏水性ADC的DAR,顺利完成快速、高效的分离。
用于分析生物偶联物和抗体偶联药物的沃特世反相色谱柱(例如ACQUITY和XBridge Premier BEH C4蛋白分析专用柱)特别采用了MaxPeak HPS技术,能够尽量减少ADC与色谱柱硬件之间的次级相互作用,是分析赖氨酸偶联ADC的理想之选。与半胱氨酸偶联ADC不同,在赖氨酸偶联ADC中,mAb重链和轻链之间的连接由完整的链内二硫键维持。因此,如果连接子在酸性pH条件下不稳定,更适合采用反相色谱法来分析赖氨酸偶联ADC。此外,沃特世还有采用实心核颗粒技术的反相色谱柱(例如BioResolve RP色谱柱),适合在完整蛋白质和亚基分析中帮助确定结构域水平的连接药物定位。
在磷酸盐缓冲液(即PBS)平台方法分析中,无需为不同的蛋白质配制多种SEC洗脱液流动相,使用Waters SEC色谱柱就能持续获得准确的聚集体、单体和片段数据。 此外,由于MaxPeak Premier SEC蛋白分析专用柱填充的是PEO键合BEH颗粒,用它分析可能发生不良次级相互作用的疏水性生物偶联物时无需添加有机溶剂。
使用BioResolve SCX mAb色谱柱和BioResolve CX pH浓缩缓冲液运行盐梯度或pH梯度,尽可能减少光学检测中的次级相互作用,从而准确测量半胱氨酸和赖氨酸连接ADC的电荷异构体图谱。如需将离子交换色谱与质谱联用,以探索深层次的结构信息,可选用我们的IonHance CX-MS pH浓缩缓冲液,这款高纯度、挥发性的缓冲液兼容质谱分析,使得在线IEX-MS分析成为现实。
抗体寡核苷酸偶联物(AOC)常用于蛋白质诊断,是一种很有前景的靶向细胞疗法。每增加一个偶联位点,AOC的净负电荷就会随之增加,在阴离子交换树脂上的保留性也随之增加。GenPak FAX色谱柱含弱阴离子交换吸附剂,对蛋白质和寡核苷酸样品具有可控的保留性和特殊的选择性。最近的应用研究表明,AEX可与MALS结合使用以获取绝对分子量信息。
亲水作用色谱(HILIC)被广泛用于分离小分子极性化合物,但除了游离寡糖外,该技术在生物大分子分析中的应用非常有限。 有了沃特世大孔径糖蛋白分析专用柱,过去使用HILIC难以获得的完整蛋白质(糖基化或未糖基化)、蛋白质片段和复杂游离寡糖信息现在均可轻松获取。
Waters PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒适用于手动或自动工作流程,可在2.5小时内为您的实验室提供高效、可重现的肽图,速度是普通自制方法的4倍。采用1:5的酶:肽比,酶解仅需30 min,漏切位点减少78%,受污染的自溶峰减少98%。PeptideWorks非常适合用于测定药物偶联位点、表征蛋白质结构、鉴定蛋白质,以及监测蛋白质修饰(包括翻译后修饰)。
使用GlycoWorks试剂盒,重新构建一种精简、快速且高灵敏度的ADC N-糖分析方法。这套解决方案可配合Waters Andrew+移液机器人实现自动化,不仅能在游离N-糖分析中展现出色的荧光和质谱检测性能,还能大幅提高效率。GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒大幅简化了复杂耗时的样品制备环节,只需3个简单步骤,在短短30 min内就能制备好样品。
ProteinWorks eXpress快速酶解试剂盒可简化和加速蛋白质酶解。利用经过预先检测、具有批次可溯源性的试剂和标准化方案,对血浆和血清中的蛋白质(包括ADC)进行准确、精密且灵敏的LC-MS定量分析。使用针对各种工作流程(包括蛋白质生物分析/DMPK)优化过的试剂盒获得出色的性能和灵活性,实现可重现的蛋白质酶解。
借助采用MaxPeak Premier技术的Waters BioResolve蛋白A亲和色谱柱加快抗体滴度测定。这些高性能色谱柱可帮助您实现高达7倍的灵敏度提升,从而加快决策制定和实现更好的流程控制。这些色谱柱还可解锁高级分析工作流程,包括简化的Direct Connect 2D ProA‑SEC和ProA‑MS方法。助您简化分析流程,全面深入地了解您的抗体。
使用HIC分析半胱氨酸偶联ADC。测定了三种不同半胱氨酸偶联ADC样品随载药量增加的药物分布。
在BioAccord系统上收集的天然(上)和高DAR mAb(下)的高斯拟合DSC ADC结果。
在XBridge Premier SEC 250 Å 2.5 µm 4.6 × 150 mm蛋白分析专用柱上对曲妥珠单抗-美坦新偶联物(A)和贝伐珠单抗(B)进行的快速SEC分析。流动相:1x PBS,pH 7.4,流速F = 0.7 mL/min,温度T = 25 °C,进样体积1 μL,检测:280 nm (UV)。
偶联与未偶联曲妥珠单抗的肽图分析(UV色谱图)比较
上图:曲妥珠单抗生物类似药的胰蛋白酶酶解。
下图:曲妥珠单抗-美坦新偶联物Kadcyla(抗体偶联药物)的胰蛋白酶酶解。
两种物质的胰蛋白酶酶解均使用RapiZyme胰蛋白酶和PeptideWorks胰蛋白酶酶解试剂盒,在XSelect Premier CSH C18, 2.5 µm, 2.1 × 150 mm肽分析专用柱上进样100 μL(约10 µg)进行分析。与未偶联曲妥珠单抗(上图)相比,在Kadcyla色谱图(下图)中观察到了更多的峰。