Umkehrphasenchromatographie

Die Umkehrphasenchromatographie (auch: Reversed-Phase-Chromatographie) ist die heute bei weitem am häufigsten im Labor angewendete Separationstechnik in der Flüssigkeitschromatographie. Ihre Popularität spiegelt sich wieder in der großen Auswahl an Säulenprodukten, die Waters für diese Technik anbietet.

In ihrer einfachsten Form besteht die Umkehrphasenchromatographie aus einer polaren mobilen Phase, meist Mischungen von Wasser oder einem Puffer mit polaren Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran, und einer unpolaren stationären Phase wie zum Beispiel einem langkettigen Kohlenwasserstoff, der an eine Silika- oder Hybridbasis gebunden ist. In den letzten Jahren wurde erhebliche Forschungs- und Entwicklungsarbeiten im Bereich der Trennmedien geleistet, um Säuleneffizienz und pH-Stabilität zu verbessern und neue Selektivitäten anzubieten.

Die aktuellen Säulenmaterialien von Waters können grob in drei Kategorien eingeteilt werden:

• Hybrid: extreme pH-Stabilität für maximale Flexibilität bei der Methodenentwicklung. Erhältlich unter den Markennamen XBridge™, ACQUITY^® BEH und XTerra^®. pH-Bereich 1-12.
• Silika: Die SunFire™ und Symmetry^® Produkte waren in der Vergangenheit die meistgenutzten Produkte in der Umkehrphasenchromatographie. Sie werden im Waters-Produktionsbetrieb in Taunton aus Rohmaterialien hergestellt und sind auf maximale Beladbarkeit ausgelegt. pH-Bereich 2-7.
• Anwendungsspezifisch: für spezielle Anwendungsgebiete, zum Beispiel die Atlantis^® Säulen zur besseren Retention polarer Moleküle.

Normalphasenchromatographie

Vor der Entwicklung der Umkehrphasen war die Normalphasenchromatographie (auch: Normal-Phase-Chromatographie) die verbreiteteste Trennmethode. Hierbei wird die Wechselwirkung von Analyten mit polaren funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der stationären Phase ausgenutzt. Diese Wechselwirkung ist bei Nutzung von unpolaren Lösungsmitteln als mobile Phase am stärksten.

Die Normalphasenchromatographie ist eine sehr leistungsfähige Trennmethode, da eine große Auswahl an Lösungsmitteln benutzt werden kann, um die Selektivität einer Trennung genau abzustimmen. Bei vielen Chromatographieanwendern hat sie allerdings wegen ihrer Komplexität an Beliebtheit verloren. Unter bestimmten Bedingungen können lange Äquilibrierungszeiten oder Probleme mit der Reproduzierbarkeit auftreten, deren Hauptgrund die Empfindlichkeit der Technik gegenüber niedrigen Konzentrationen polarer Kontaminanten in der mobilen Phase ist. Wenn diese Probleme beherrscht werden, liefert die Technik normalerweise bessere Chromatogramme als Umkehrphasen-Methoden, da die üblicherweise verwendeten Lösungsmittel eine niedrigere Viskosität besitzen.

Normalphasensäulen sind in den Produktfamilien SunFire, Nova-Pak und Spherisorb erhältlich.

HILIC (Hydrophile Interaktionschromatographie)

Die hydrophile Interaktionschromatographie wird schon seit langem angewendet, wobei die Bezeichnung HILIC erst seit kurzem gebräuchlich ist. Die Analyte sind sehr polare Verbindungen, wie zum Beispiel polare Metaboliten, Kohlenhydrate oder Peptide.

Die HILIC kann als eine Erweiterung der Normalphasenchromatographie im Bereich der wässrigen mobilen Phasen betrachtet werden. Die mobilen Phasen sind Mischungen aus Wasser oder Puffer (< 40%) mit organischen Lösungsmitteln. Die stationären Phasen sind sehr hydrophile polare Adsorbentien wie Silika, polare gebundene Phasen, polare polymere Packungsmaterialien und Ionenaustauscher. Der gemeinsame Faktor aller dieser stationären Phasen ist, dass sie leicht Wasser adsorbieren können, daher die Kategorisierung als „hydrophil“.

Die Gradientenmethoden in der HILIC-Technik sind genau das Gegenteil der Methoden in der Umkehrphasentechnik. Die Anfangsbedingungen bestehen aus einem hohen organischen Anteil, typischerweise 95%, und bewegen sich dann progressiv zu einem höheren Anteil an wässrigem Lösungsmittel. Aus diesem Grund wird auch der Ausdruck „reversed-reversed-phase“ (umgekehrte Umkehrphase) benutzt.

Die Technik wird immer beliebter, und ist daher das Thema intesiverer Forschungen zu Säulenpackungsmaterialien.

HILIC-Säulen von Waters sind zur Zeit in den Produktfamilien Atlantis, XBridge und ACQUITY^® erhältlich.

Ionenaustauschchromatographie

Bei der Ionenaustauschchromatographie bestimmen die Nettoladung und die Ladungsverteilung auf der Oberfläche eines Proteins die Wechselwirkung des Proteins mit den geladenen Gruppen auf der Oberfläche des Packungsmaterials. Die Oberflächenladungen von Protein und Packungsmaterial müssen entgegengesetzt sein, damit eine Interaktion stattfinden kann. Die manipulierbaren Variablen, wie der pH-Wert des Puffers, die Pufferzusammensetzung, die Steigung des Gradienten und das Salz, mit dem der Gradient aufgebaut wird, ermöglichen eine große Auswahl an Möglichkeiten zur Optimierung einer Trennung.

Größenausschluss-Chromatographie

Das Trennprinzip der Größenausschluss-Chromatographie ist die apparente Größe und Form von Biomolekülen in Lösung. Eine erfolgreiche Auftrennung von Proteinmischungen mit dieser einfachen Trennmethode richtet sich nach den Größenunterschieden der Biomoleküle, dem Packungsmaterial, der Poren- und Partikelgröße und nach den Betriebsbedingungen, wie zum Beispiel Probenmasse und -volumen. Packungsmaterialien für die Größenausschluss-Chromatographie haben sich von weichen Polysaccharidgelen mit großen Partikeln zu festen Packungsmaterialien mit geringerer Partikelgröße entwickelt, die eine höhere Auflösung und erheblich schnellere Trennungen ermöglichen.

Die Größenausschluss-Chromatographie findet weite Anwendung bei der Proteinisolation. Oft wird sie zur Fraktionierung benutzt, da die Laufzeiten recht kurz sind und die Technik recht unkompliziert. Sie kann auch zur Umpufferung verwendet werden, da die Puffersalze mit niedrigem Molekulargewicht leicht von den erheblich größeren Proteinen getrennt werden können.

Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie ist die einzige Chromatographiemethode, bei der Biomoleküle (zum Beispiel monoklonale Antikörper oder rekombinante Proteine) aufgrund ihrer biospezifischen Interaktion mit einem immobilisierten Liganden isoliert werden. Biomoleküle können so mit einer hohen Aktivitätsausbeute und in einer guten Reinheit gewonnen werden. Moderne Packungsmaterialien für die Affinitätschromatographie bestehen aus stabilen Grundstoffen, die eine für die Auftrennung von Rohfraktionen geeignete erhöhte Bettstabilität mit einem hohen Durchsatz für schnelle Aufreinigungen im Mikrogramm- bis Grammbereich vereinen. Viele Trennungen können in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, was zu erheblichen Kosteneinsparungen führt.

Hydrophobe Interaktionschromatographie

Diese Chromatographiemethode wird hauptsächlich oder sogar ausschließlich mit Proteinen angewendet, die unter hoher Ionenstärke an eine mäßig hydrophobe Oberfläche binden. Anschließend wird das Protein dann mit einem Gradienten mit sinkender Ionenstärke eluiert. Die hydrophobe Interaktionschromatographie liefert oft eine gute Auflösung und erhält die biologische Aktivität. Es werden wässrige Puffersysteme benutzt. Die Auflösung wird von vielen verschiedenen Faktoren beeinflusst, zum Beispiel von der Konzentration und Art der Puffersalze, dem pH-Wert des Puffers, von Detergenzien, Zusatzstoffen („Modifiern“), der Säulentemperatur und der Funktionalität des Packungsmaterials. Da Proteine bei hoher Ionenstärke auch miteinander wechselwirken können, erzielt man bessere Auflösungen, wenn das Anfangsmaterial schon vorgereinigt ist. Bei hoher Ionenstärke ist außerdem das Beladen mit großen Probenvolumina nicht praktikabel. Deshalb ist die hydrophobe Interaktionschromatographie günstig als zweiter oder späterer Schritt in einer Aufreinigungsmethode, zum Beispiel nach einer Ammoniumsulfatfällung.