Ionenaustauschtrennungen werden meistens mit Salz oder pH-Gradienten gefahren, wobei weniger geladene Proteine früher eluieren als höher geladene Moleküle. Je nach Protein und pH-Wert der mobilen Phase werden entweder Anionen- oder Kationenaustauscher eingesetzt. Darüber hinaus spielen Gradientendauer, Pufferzusammensetzung, pH-Wert, Flussrate und Temperatur eine wichtige Rolle für eine erfolgreiche Trennung.