Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

La cromatografia è definita come la separazione di una miscela in base agli attributi chimici dei componenti al suo interno. Per cromatografia preparativa (Prep) o di purificazione si intende il processo mediante il quale si utilizza la cromatografia per isolare un composto in una quantità e a un livello di purezza sufficienti per ulteriori esperimenti o procedure operative. Uno scienziato determina un composto di interesse, quindi sviluppa un metodo per separare e isolare correttamente tale composto da materiali di partenza, reazioni secondarie o altre impurezze. L’obiettivo generale è soddisfare le crescenti esigenze di rendimento e produttività elevati, adattando allo stesso tempo le tecniche di purificazione per soddisfare i requisiti di scala, purezza e riproducibilità appropriati.

La cromatografia di purificazione è utilizzata in molti ambienti scientifici, dalle grandi organizzazioni farmaceutiche ai piccoli gruppi di ricerca sui prodotti naturali. Anche se le aree di applicazione possono differire, i requisiti generali dell’utilizzatore sono abbastanza simili, con un livello di purezza finale desiderato pari o superiore al 95% per l’isolamento target.

Lo scopo di questo manuale è fornire informazioni introduttive sul campo della purificazione LC in rapida espansione a chi si occupa di cromatografia liquida. Vengono introdotti i principi fondamentali quali lo sviluppo di un metodo di separazione cromatografica, le equazioni matematiche necessarie per lo scale-up del metodo e le modalità comunemente utilizzate per la raccolta delle frazioni. La modalità di separazione in fase inversa viene indicata come la principale poiché è utilizzata nella maggior parte delle applicazioni LC preparative.

Il successo di un isolamento tramite purificazione è determinato dalla produttività, dal recupero e dalla purezza dell’isolato ottenuto. L’isolamento è guidato dalla separazione dei picchi o dalla “risoluzione”. I seguenti parametri cromatografici hanno l’impatto più significativo sulla risoluzione:

• Materiale di impaccamento della colonna (fase stazionaria)
• Forza del solvente

Le condizioni che garantiscono una risoluzione ottimale sono determinate eseguendo un workflow di sviluppo del metodo. Il workflow è abbastanza semplice ma consiste in più step, che variano in complessità e necessità in base alle proprietà uniche di ciascun campione. Indipendentemente dall’applicazione o dalla modalità di separazione dei campioni (cioè fase inversa, scambio ionico, ecc.), il workflow sarà generalmente lo stesso.

Il fattore più importante da considerare prima di progettare un workflow è la natura del composto target. Se si isola un composto noto dalla stessa sorgente o da una nuova, è facile ottenere informazioni bibliografiche sul comportamento cromatografico del composto target e il metodo di isolamento appropriato può essere selezionato con poche difficoltà tra i metodi pubblicati in precedenza. Tuttavia, è più difficile progettare un protocollo di isolamento per un estratto grezzo in cui i tipi di composti sono incogniti. In questo caso, dopo l’isolamento iniziale, è possibile eseguire una serie di esperimenti esplorativi per ottenere ulteriori informazioni sul composto di interesse, quali pK_a, peso molecolare, solubilità, stabilità, spettri UV e attività biologica. A partire da queste informazioni, il metodo di separazione iniziale può essere modificato per soddisfare i requisiti chimici e fisici del composto. Queste informazioni non sono utili soltanto per lo sviluppo del metodo, ma anche dopo la raccolta quando diventa importante la stabilità del prodotto isolato.

Il primo passaggio consiste nel preparare un campione ed eseguire una separazione generale utilizzando un gradiente di esplorazione rapido. In genere questa operazione viene eseguita su piccola scala per conservare il prezioso materiale del campione. Da questa separazione è possibile calcolare la condizione del solvente che eluisce il composto di interesse e ottimizzare ulteriormente le condizioni di separazione per massimizzare la risoluzione. È anche possibile eseguire uno studio di caricamento per determinare la quantità di campione che è possibile caricare mantenendo una risoluzione adeguata a produrre un isolato altamente puro.

Dopo aver stabilito il metodo di separazione e il carico di campione desiderato, spesso viene eseguito lo scale-up del metodo per qualsiasi isolato con valore promesso o potenziale. Ai fini del presente manuale di base, il termine “scala” descrive la strumentazione e la metodologia necessarie per raggiungere gli obiettivi di purezza, produttività e resa per l’applicazione. Quando un metodo viene sottoposto a “scale-up”, viene spostato in un sistema con componenti hardware adatti a gestire carichi di campione più elevati. Lo scale-up implica essenzialmente il passaggio da una colonna analitica a quella di diametro preparativo mantenendo la risoluzione attraverso una serie di calcoli di scale-up e modifiche hardware.

Campioni

I campioni dai quali è possibile isolare un composto specifico provengono da un’ampia gamma di sorgenti, tra cui farmaci intermedi, prodotti naturali, nutraceutici, bevande o prodotti industriali. Finché un materiale può essere estratto e dissolto in una matrice liquida, i singoli componenti possono essere purificati mediante cromatografia.

Le tecniche utilizzate per l’estrazione del campione dipendono dalla complessità del materiale da cui viene estratto. Per i prodotti naturali, in genere il campione viene essiccato e macinato in particelle fini per incrementare l’efficienza dell’estrazione. Per estrarre i composti di interesse è quindi possibile utilizzare una tecnica come la percolazione, per campioni di grandi dimensioni, o la macerazione, per campioni di piccole dimensioni. Entrambe le tecniche comportano l’aggiunta di un solvente al materiale del campione e la raccolta del soluto dopo la sonicazione, la centrifugazione o l’immersione. Dopo aver raccolto l’estratto, come con tutti i campioni HPLC, deve essere filtrato per rimuovere le particelle e deve essere privo di bolle prima dell’iniezione.

Modalità di Separazione

Esistono quattro modalità principali di separazione utilizzate nella cromatografia preparativa, che includono la fase inversa, la fase diretta, la permeazione di gel e lo scambio ionico. La modalità di separazione appropriata è determinata dalla compatibilità della fase stazionaria e dei solventi con il campione, l’estratto o la miscela da analizzare.

La fase inversa è la tecnica utilizzata più comunemente per lo sviluppo della purificazione e utilizza una fase stazionaria meno polare rispetto al solvente di eluizione. L’eluente è una miscela di acqua e acetonitrile o metanolo, mentre vengono aggiunti tamponi (acidi o basi) per controllare il grado di ionizzazione del campione e occupare gruppi silanolo liberi non reagiti presenti nella fase stazionaria. I materiali della fase legata o i sorbenti nelle fasi stazionarie a base di silice sono derivatizzati con reagenti alchil-sililici per ridurre lo scodamento del picco e migliorare la riproducibilità cromatografica. Il grado di caricamento del carbonio di questi reagenti derivatizzati (silanizzazione) può conferire caratteristiche di separazione uniche a colonne di produttori diversi.

Sviluppo Rapido di Metodi

Per stabilire una separazione in fase inversa, spesso viene selezionata una colonna analitica su piccola scala (diametro ≤4,6 mm) con una lunghezza e materiale di impaccamento disponibili in un diametro su larga scala (diametro ≥10 mm) per facilitare lo scale-up futuro. È fondamentale individuare il sistema di solventi corretto per ottenere una separazione ottimale. Per i composti acidi in genere si prepara una fase mobile acquosa a pH acido, mentre si preparano metanolo o acetonitrile come solventi forti. L’acido formico, pari allo 0,1% in concentrazione, è un additivo tampone usato comunemente perché è compatibile sia con gli UV che con la spettrometria di massa. La compatibilità MS è utile per identificare composti incogniti e preparare un isolato purificato per ulteriori studi. Per mantenere la forma unionizzata delle molecole basiche è possibile utilizzare una fase mobile a pH basico anziché a pH acido. Consultare il foglio illustrativo della fase stazionaria della colonna per verificare la compatibilità prima di utilizzare un tampone con qualsiasi pH.

La fase mobile acquosa in genere è situata nella posizione pompa A e il solvente forte nella posizione pompa B. Le lettere “A” e “B” saranno utilizzate in questo manuale di base per fare riferimento rispettivamente alla soluzione acquosa e al solvente forte nelle tabelle delle pompe.