在临床研究中使用新型Xevo™ TQ Absolute IVD对血清雌激素进行UPLC-MS/MS分析

本应用简报展示了Xevo TQ Absolute IVD质谱仪在临床研究中用于分析一组血清雌激素时表现出的优异灵敏度和定量性能。

优势

• 使用Xevo TQ Absolute IVD定量分析低浓度17β-雌二醇和雌酮
• 采用简单的液液萃取样品前处理方法
• 17β-雌二醇和雌酮可实现UPLC分离，以便进行选择性检测

17β-雌二醇(E2)和雌酮(E1)是非妊娠状态下人体内的两种主要生物活性雌激素。E2主要由卵巢和睾丸通过睾酮芳香化生成，而E1主要通过雄烯二酮的衍生生成。E2可以代谢为E1，并且E1也可以转化为E2，因此研究人员需要测定这两种化合物。

该分析最大的难点在于，某些临床研究应用需要测定浓度极低的E2和E1。目前使用的某些免疫分析技术灵敏度不佳且缺乏普适的选择性，而已发表的LC-MS/MS方法样品用量大、样品萃取方法复杂，通常都包括衍生化步骤。

Xevo TQ Absolute IVD质谱仪采用了StepWave™ XS离子传输光学元件和Xtended Dynamic Range (XDR)，线性动态范围覆盖六个数量级，并具有出色的灵敏度、稳健性和可靠性。这款质谱仪配合简单的样品前处理方法及雌激素UPLC™分离方法，可得到一种选择性和分析灵敏度俱佳的E2和E1分析方法供临床研究使用。 

样品前处理和UPLC-MS/MS分析

E2和E1认证参比溶液及其稳定标记内标(¹³C₃)购自Merck（英国吉林汉姆）。使用购自Golden West Biologicals（美国加利福尼亚州特曼库拉）的替代基质MSG4000（处理血清）制备标准曲线样品。E2的标准曲线范围为2~1000 pg/mL，E1为1~1000 pg/mL。使用购自Golden West Biologicals（美国加利福尼亚州特曼库拉）的替代基质MSG4000（处理人血清）制备浓度为3.2 pg/mL、10.5 pg/mL和700 pg/mL的QC样品。水、甲醇和乙酸乙酯购自Fisher Scientific（英国拉夫堡）。氟化铵和己烷购自Merck（英国吉林汉姆）。 

将E2数据乘以3.671，E1数据乘以3.699即可将传统的质量单位(pg/mL)转换为SI单位(pmol/L)。

向250 μL样品中加入20 μL内标并混匀。加入1 mL 85:15 (v:v)己烷:乙酸乙酯，充分混合10 min以进行液/液萃取。样品以4000 g离心5 min，然后取700 µL上层有机层转移到带有1 mL玻璃内衬管的96孔板中（沃特世P/N：186000855）。将样品挥干并复溶于20 µL甲醇和30 µL蒸馏水中。

随后将样品进样至ACQUITY UPLC I-Class FL/Xevo TQ Absolute IVD质谱仪联用系统，采用水/甲醇/氟化铵梯度（见表1）和Waters™ CORTECS™苯基柱（沃特世P/N：186008319）进行分析。

表2列出了检测每种分析物采用的多重反应监测(MRM)通道、定量离子(quan)和定性离子(qual)，实验采用电喷雾负离子模式，毛细管电压为2.2 kV，MS1和MS2分辨率设置为0.7 FWHM。 

E2和E1实现了色谱分离，进样间的间隔时间约为5.5 min。典型色谱图如图2所示。

标准曲线在前文所述的标曲范围内呈线性，相关系数>0.99，八个数据点处E2和E1的结果偏差(%)都在±15%以内（标曲样品1为±20%）。

通过萃取和分析低、中、高浓度QC样品（每个浓度五个重复样）来评估精密度性能。在所有浓度水平下，所有类固醇激素的批次内精密度和总精密度均为CV≤5.9%，结果汇总于表3中。

我们通过分析加标低浓度E2和E1的Golden West Biologicals MSG4000处理血清评估了该方法的分析灵敏度。共设四个加标浓度，每种样品制备十个萃取重复样并进行分析。E2和E1在1.0 pg/mL浓度下的%CV≤20%且偏差≤15%，但E2在该浓度下的（峰到峰）信噪比未达到≥10:1的标准，因此E2的LLOQ被定为3 pg/mL。图3所示为E2在上述浓度下的典型色谱图。尽管LLOQ没有达到1 pg/mL，但空白的处理血清样品与加标了1 pg/mL E2的处理血清样品可以很好地区分开来。

我们使用来自六个供体的血清样品研究了基质效应。单独定量内源性干扰物的峰面积，使用平均峰面积调整低浓度和高浓度萃取后加标样品的结果，以便与溶剂加标样品的结果进行比较。虽然通过峰面积可以观察到一定的基质抑制和基质增强效应，但内标可以补偿这些变化（表4）。

准确度的评估方法是分析40个UK NEQAS E2样品并计算浓度，然后将所得浓度与质谱实验室截尾均值比较。表5和图4中可以看到E2的相关性，所得结果与EQA计划值具有良好的一致性。 

Xevo TQ Absolute IVD在临床研究的17β-雌二醇和雌酮分析中表现出优异的分析灵敏度和定量性能，分析方法具有如下的性能特征：

• 所有分析批的E2和E1标准曲线相关系数(r²)均>0.99。
• 批次内精密度和总精密度结果为CV≤5.9%。
• E2的分析灵敏度达到3.0 pg/mL (11.1 pmol/L)，E1达到1.0 pg/mL (3.7 pmol/L)，%CV≤20%，偏差≤15%，峰到峰信噪比>10:1。此外，该方法仅用250 μL样品且无需衍生化步骤即可区分空白的处理血清样品与加标1 pg/mL E2的相同基质样品。
• 将采集自6个供体的样品的实测浓度计算值与对照样品相比较，几乎没有观察到离子抑制效应。
• 通过比较UK NEQAS E2计划值得出Deming拟合为y = 0.971x + 4.874，Bland Alman平均偏差为-4.15%，证明该方法具有较高的准确度。