在临床研究中利用UPLC-QDa分析血清中的维生素A和E

本文介绍了一种利用单四极杆质谱检测器ACQUITY QDa同时分析血清中维生素A和E的临床研究方法。萃取方法为之前所用LC-MS/MS方法的改进版，使用HLB Prime进行样品制备。色谱分析采用ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱进行，结合SIR模式下的ACQUITY QDa检测，提供了一种准确、灵敏的方法来分析血清中的维生素A和E。进样周期仅5 min，对血清中维生素A和E的灵敏度分别达到100 ppb和1 ppm。

优势

• 使用单四极杆质谱检测器ACQUITY QDa和ACQUITY UPLC H-Class系统对血清中的维生素A和E进行分析的一种准确、灵敏的方法
• 样品制备方法相比LLE更为简单

过去，大多数维生素A和E分析都是采用配备UV检测器的HPLC系统。即使采用LC-MS/MS方法分析维生素A和E，液-液萃取(LLE)等萃取方法仍需要很长的萃取时间，且溶剂消耗量大，分析时间长。之前，我们已经展示了一种基于LC-MS/MS的临床研究方法，该方法仅需要100 μL的样品体积，并缩短了分析时间¹。 利用Oasis HLB PRiME (SPE)去除磷脂是性能提升的关键因素。本技术简报将展示LC-MS如何对血清中的维生素A和E实现准确、灵敏地分析。

将同位素标记的内标加入100 μL血清中，然后添加乙醇进行蛋白沉淀。离心后，将上清液用乙醇/水(5:3)稀释，使乙醇/水的最终比例为2:3。将650 μL所得溶液加载到Oasis HLB洗脱板上进行样品净化。用20%乙腈水溶液洗涤样品，然后用100%乙腈洗脱。将洗脱液用水进一步稀释至200 μL（图1）。利用HLB PRiME可免去活化和蒸发步骤。将20 μL所得提取物进样至LC-MS进行分析。

使用装配ACQUITY HSS PFP色谱柱（1.8 μm, 2.1 x 50 mm，部件号：186005965）的ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统，用65%流动相A (MP A)增加至100% MP A的梯度进行洗脱，以达到分离目的。利用ACQUITY QDa在ESI正离子和SIR模式下检测相应的质子化加合物。进样周期为5 min。

图2显示了经处理的血清(MSG2000)中100 ppb维生素A和1 ppm维生素E的色谱图。分析灵敏度研究表明，100 ppb维生素A和1 ppm维生素E均可实现定量分析（%RSD <20，偏差<15%，S/N >10）。对于维生素A，该方法在100 ppb至2000 pp的范围内呈线性；对于维生素E，则在1 ppm至20 ppm的范围内呈线性。两种化合物在10次独立试验中得到的相关系数(r²) >0.993。图2列举了一些标准曲线。

通过在5天内提取并分析经处理的血清中低浓度到高浓度的5个重复样品(n = 25)，评估方法精密度。维生素A和E在所有检测浓度下的重复性和总精密度均≤8% CV，结果汇总于表1中。测试样品与对照样品相比，检测的典型内源性干扰物质的所有%回收率计算值均在±15%以内。

使用内标进行补偿后，来自六个供体的测试样品与对照样品之间的基质因子结果在±15%范围内（表2）。在维生素E中观察到基质抑制作用（平均值=0.653和0.730），但得到内标补偿（平均值=0.977和0.939）。

本文探讨了UPLC单四极杆质谱系统ACQUITY UPLC-ACQUITY QDa在脂溶性维生素临床研究分析中的应用。结果表明，即使在复杂基质中，该方法也具有良好的准确度和分析灵敏度。与LLE相比，样品制备相对简单，运行时间相比传统的HPLC-UV方法大大缩短。

1. Simultaneous Analysis of Vitamin A and E in Serum by UPLC-MS/MS for Clinical Research.Waters Corporation, UK, 2019. Waters Application Note 720006642EN.