RapiZyme RNasen
Abstimmbarer RNA-Verdau für eine optimierte LC-MS-Sequenzierung
sgRNA und mRNA von CRISPR erfordern eine gründliche Charakterisierung, um ihre Identität, Sequenzen und Reinheit zu bestätigen. Diese RNA-Moleküle sind aufgrund ihrer komplexen Funktionalität, Modifikationen und vorhandenen Varianten hervorragende Kandidaten für die LC-MS-Analyse. Durch ihre Größe wird ein Verdau mit einer Endonuklease wie einer RNase häufig vor der Injektion durchgeführt. Die resultierenden Verdauprodukte können leicht mithilfe von Ion Pairing Reversed-Phase (IPRP) oder hydrophiler Chromatographie (HILIC) in Kombination mit Massenspektrometrie (MS) nachgewiesen werden.
Waters RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin bieten eine kontrollierte, reproduzierbare RNA-Spaltung an einer Reihe von Dinukleotidstellen. RapiZyme RNasen produzieren eine Vielzahl einzigartiger RNA-Fragmente mit komplementärer Überlappung. Für LC-MS-Anwender bietet dies abstimmbare Verdaus, die das Vertrauen bei der Peakidentifikation optimieren und somit für eine bessere Sequenzabdeckung und mehr molekulare Erkenntnisse sorgen. Jedes Röhrchen enthält 10.000 Einheiten RapiZyme RNase. Dies ist genug Enzymreagenz, um bis zu 100 Verdaureaktionen von 10-µg-RNA-Proben durchzuführen.
- Erzielen Sie eine maximale Sequenzabdeckung für mRNA und sgRNA.
- Arbeiten Sie mit RNasen, die speziell für die LC-MS-Analyse entwickelt wurden.
- Verzichten Sie auf Denaturierungsmittel und RNase-Inhibitoren bei der Durchführung von Verdaus.
- Erzielen Sie sauberere Signale und Empfindlichkeiten mit zyklischen Phosphatprodukten.
- Beschleunigen Sie die Entwicklung und Analyse von RNA-Therapeutika.
RapiZyme RNasen
Technische Daten
Überblick
- Verbesserte Ergebnisse mit vollständigerer Sequenzabdeckung für die LC-MS-Charakterisierung von RNA
- Verbessern Sie die Effizienz mit hochreinen, hochaktiven Enzymreagenzien auf bis zu 100 Reaktionen je nach Substrat.
- Vereinfachen Sie Ihre Analyse mit einem zur Automatisierung bereiten Protokoll für den Verdau.
- Vermeiden Sie Überverdau und Geräte-/Säulenkontamination durch zuverlässige Wärme-Inaktivierung, die keine zusätzlichen Inhibitor-Reagenzien erfordert.
- Zielen Sie mithilfe von zwei enzymatischen Spezifitäten auf Uridin- oder Cytidin-Reste ab.
- Maximieren Sie die Empfindlichkeit und vereinfachen Sie die Dateninterpretation mit in waters_connect MAP Sequence integrierten Enzymverdaueigenschaften.
- Fügen Sie IonHance HFIP Additiv für die mobile Phase hinzu und profitieren Sie von einer 2-fachen Verringerung unerwünschter Natrium- und Kaliumaddukte.
Empfohlene Verwendung: Für eine verbesserte Sequenzabdeckung bei CRISPR sgRNA- und mRNA-Therapeutika.
Auf Ausschau nach dem Verdau
RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin weisen reproduzierbare Spaltungsspezifitäten auf. Zur Untersuchung von RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin wurden doppelt markierte, gequenchte RNA-Substrate eingesetzt. Nach der Spaltung durch die RNase wird ein FAM-markiertes Testsubstrat von seinem Black Hole Quencher-Konjugat getrennt. Das Verdauereignis wird dann mithilfe von Techniken auf Absorptionsbasis erfasst, sodass eine quantitative Messung der On-Target-Spaltung möglich ist. Zusätzlich wird eine Negativkontrolle, das HEX-markierte Substrat (z. B. polyA), angewandt, um die Off-Target-Spaltung zu beurteilen. Das FAM/HEX-Verhältnis gibt Aufschluss über die Aktivität jedes Enzyms und kann unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich Temperatur, pH-Wert, Pufferzusammensetzung, Enzymeinheiten und Zeit, durchgeführt werden. Diese Analysen wurden durchgeführt, um die optimalen Reaktionsbedingungen für RapiZyme Cusativin und RapiZyme MC1 zu bestimmen.
Jetzt wird‘s spezifisch
RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin sind hochreine, hochaktive RNasen, die komplementäre Spaltungsspezifitäten bieten. Diese rekombinanten, abstimmbaren Enzyme sind darauf ausgelegt, die Entwicklung und Analyse von RNA-Therapeutika durch einen kontrollierten Verdau von synthetischen Oligonukleotiden, mRNA und sgRNA zu beschleunigen. RapiZyme MC1 weist die selektivsten und effizientesten Verdauraten bei [A/U/C]pU-Dinukleotidbindungen bei einem pH-Wert von 8 auf, wohingegen RapiZyme Cusativin Cp[U/A/G]-Dinukleotidsequenzen bei einem pH-Wert von 9 am effizientesten und selektivsten spaltet. Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Enzym-Substrat-Verhältnis können geändert werden, um probenspezifische Effekte zu optimieren.
Alles Grundlegende abgedeckt
RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin zeigen eine Präferenz für Substrat-Kopplungen und Spaltungen an spezifischen Dinukleotidpositionen. RapiZyme MC1 hat die Tendenz, am 5'-Ende von Uridin zu spalten, und RapiZyme Cusativin neigt dazu, am 3'-Ende von Cytidin zu spalten. Beide Enzyme weisen kontrollierte, wiederholbare Spaltprodukte auf. Die spezifische Natur dieser RNasen führt zu einem teilweisen Verdau, wodurch längere Produkte neben eindeutigen und überlappenden Fragmenten erzeugt werden. Ein teilweiser Verdau, der eine Fülle an Informationen liefert, erzeugt eine stärkere Vielfalt an Fragmenten, die zur Strukturaufklärung untersucht werden müssen. Die Dateninterpretation kann mit Informatiktools wie waters_connect MAP Sequence beschleunigt werden, die In-silico-Fragmente (mRNA-Spalter) auf Basis der bekannten Spaltungseigenschaften des gewählten Enzyms vorhersagen und die beobachteten Daten der Sequenz des zu untersuchenden RNA-Moleküls zuordnen.
Was Kunden sagen...
„Als Innovatoren, die unsere Kunden dabei unterstützen möchten, Nukleinsäure-Therapien voranzubringen und die Belastung durch schwere Erkrankungen zu verringern, sind wir ständig auf der Suche nach neuen Technologien, um die Charakterisierung zu verbessern und die Entwicklung zu beschleunigen. Die neuen Enzyme von Waters verdauen mRNA und sgRNA effizient bei kurzen Inkubationszeiten und die Datenprozessierung in MAP Sequence ermöglicht es dem Anwender, schnell und zuverlässig reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.“
Arnault Delobel, Ph.D., Quality Assistance
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