小粒子の明るい見通し

分離度とカラム内バンド拡散の関係

最も基本的な意味でクロマトグラフィーの分離とは何かと考えると、二つのピーク間の距離 (tR,2－tR,1)に対する二つのピークの幅 (w)になります。ピークの幅を狭くするか、互いの間隔を広くするかで分離度 (Rs)は向上します。

図14：分離度の基本式
(N)理論段数、(α)選択性、(k)保持係数

分離度は関連性のある項により構成された数式を用いて表せます。この分離度の式は、クロマトグラフィーの分離に影響を及ぼすカラム効率(N)、選択性(α)、保持能(k)で構成されます。選択性と保持能は化学的係数で、比較的容易に検討でき分離度を向上させることができました。これらのパラメーターは温度、溶出溶媒、移動相の組成、カラムなどによって左右されます。一方、カラム効率は物理的（機械的）パラメーターで、平方根が分離度に影響するため、コントロールは容易ではありません。しかしながら、粒子径を小さくすることで、分離度を大きく改善する事が可能です。UPLC テクノロジーは、効率を向上させるために2μm以下の粒子径により得られる分離度向上に重点を置いています。

上記3つの項がクロマトグラフィーでは何を表しているか（図15）を考えれば、これらのパラメーターが分離度に及ぼす影響を容易に理解できます。保持能(k)と選択性(α)は相対的にピークを移動させる化学的係数であり、分析種の固定相や移動相との作用の尺度になります。kの値を増加させることで分離度を向上させることが可能です。ただし、保持時間が長くなると感度が低下し、ピーク幅は拡がります。αを増加させると分離度が向上し、同様の時間で同じ順番でピークを溶出させたり、ピーク溶出順を変えたりすることができます。一方、カラム効率(N)は分離におけるバンド拡散の物理的尺度です。充塡剤の粒子径を小さくすることでNを向上させても、ピーク間の中心距離は変わりません。ただし、より狭く、より効率の高いクロマトグラフィーのピークを得ることが出来るため分離度と感度が向上します。

図15：化学的、機械的要因が分離度に及ぼす影響

分離度、カラム効率、粒子径の関係

UPLC テクノロジーは、装置におけるバンド拡散を最小限に抑えて分離能への物理的/機械的な寄与を最大化し、高いカラム効率を持つ2μm以下（1.7μm～1.8μm）の粒子の活用を実現する技術です。ここでは、UPLC テクノロジーにおけるクロマトグラフィー上の原理を明確に理解できるよう簡単なクロマトグラフィーの例と計算式を示します。

分離度の式で示したように、分離度はカラム効率の平方根に比例します。

図16：分離度とカラム効率の関係
カラム効率 (N)の平方根に比例する分離度 (Rs)

また、カラム効率は粒子径に反比例します。つまり、充塡剤の粒子径が小さくなるほど分離効率が向上することを意味しています。例えば、充塡剤の粒子径が5μmから1.7μm（3分の1）まで小さくなると、理論上ではカラム効率は3倍、分離度は1.7倍（3の平方根）に改善されます。

図17：一定のカラム長におけるカラム効率と粒子径の関係
カラム長を一定にした場合、カラム効率 (N)はカラム粒子径 (dp)に反比例。

理論から予測されるカラム効率と分離度の向上を実現するには、粒子径に対する最適流速で分析を実行しなければなりません。最適流量 (Fopt)は粒子径に反比例します。つまり、粒子径が5μmから1.7μm（3分の1）まで小さくなると、最適流速は3倍になり、分析時間が3分の1に短縮され、スループットが向上することを意味しています。

図18：一定のカラム長における最適流速と粒子径の関係
カラム長を一定にした場合、最適流速（Fopt）はカラム粒子径（dp）に反比例し、カラム粒子径が小さくなるのに比例して分析時間 (T)も短縮。

流速を変えた時に起こることを考察します。流速を上げると分析時間が短くなります。同時にピーク幅も狭くなります。ピーク幅が狭くなれば、これに比例してピークの高さが高くなります。ピークが狭く、かつ高くなればベースラインノイズからのピーク識別が容易になり、S/N比が向上します。つまり感度が向上します。

図19：カラム効率、ピーク幅、ピーク高さの関係
ピーク幅 (w)の減少によりカラム効率 (N)とピーク高さは向上。カラム効率 (N)はピーク幅 (w)の二乗に反比例。

これらの理論上の原理をクロマトグラフィーに当てはめてみましょう。図20からわかるように、ACQUITY UPLCシステムのようにカラム外のバンド拡散が最小化される場合、理論通りの性能を引き出す事が可能となります。

図20：理論値と実測値の比較：粒子径5μmと1.7μm
同じサイズ（2.1×50mm）の2本のカラムを用いて分析。両方の分離は同一の分析条件を適用したが、流速はカラム粒子径に基づいて変更。

これまでの説明で、カラム内のバンド拡散の重要性を検証しました。さらに、バンド拡散に影響を及ぼすプロセスとその低減方法を理解することが出来れば、カラム効率、すなわち分離度の向上を実現することが可能です。

van Deemter Curveの理解

前述のとおり、ピーク幅は分析種の分子の統計的分布（分散σ²）と考えることができます。ピーク幅は、ピークが移動した距離に比例して線形的に増加します。ピーク幅とピークの移動距離の関係は、理論段高（HET PまたはH）で説明することができます。これは蒸留理論に基づくもので、バンド拡散に関連するいくつかのプロセスを考慮に入れたカラム性能の値に相当します。よりわかりやすく言うと、HET Pが小さいほどカラムにおける理論段数（N）が大きいということになります（図21）。

図21：理論段高（HETP）の算出式：カラム長 (L)、理論段数 (N)

さらに、カラム内では分子レベルでどのようなことが起こっているか（分析種の分子が移動相や固定相とどのように相互作用しているか）を考えると、クロマトグラフィーの性能に影響する様々な拡散のプロセスを理解することができます（図22）。

この場合、拡散に関して同時に発生するのは、次の3つのプロセスです。

分析種の分子が充塡剤の表面やその周辺に運ばれる（多流路拡散）
分析種の分子が移動相中で前後に拡散する（軸方向拡散）
分析種の分子が充塡剤の細孔の内外に拡散する（物質移動）

図22：カラム内で発生する分子の拡散プロセス

拡散関連のプロセスはvan Deemterの数式で表せます。

図23：van Deemterの式

van Deemterの式は3つの項で構成されます。

A項（多流路拡散）は、主に充塡剤の粒子径に起因します。この値はカラム内の充塡密度
によっても変動し、また粒子周辺の移動相の流れが均一であるか不均一であるかにも関連し
ます。
B項（軸方向拡散）は、移動相や固定相における分析種の拡散状態に起因し、移動相の速度
（線速度）が速くなると値が小さくなります。
C項（物質移動）は、線速度（移動相の速度）と粒子径に由来する項です。分析種の分子と固
定相表面との相互作用と充塡剤の細孔内外への拡散距離を表わします。

移動相の線速度 (u)に対してHETPを作図することで、これらの項を個別に確認することができます（図24）。

図24：van Deemterの式を構成する各項

A項は水平な線として作図されます。粒子径やカラムの充塡密度に由来し、線速度（移動相の速度）とは無関係です。充塡剤の粒子径が小さくなると、H値も減少します（カラム効率の向上）。

B項は線速度が大きくなるにつれ、下降する下向きの傾斜曲線として描かれます。粒子径とは無関係で線速度が小さいと分析種の分子がカラム内に滞留する時間が長くなり、カラム内で縦方向のバンド拡散の可能性が高くなります。逆に、線速度が大きい場合、拡散する時間が短くなるためバンド拡散が起こりにくくなります。

C項は、Hとuの直線関係で作図されます。分布した分子は、固定相の細孔に入るものもあれば、次の粒子に達するまで移動相と共に進むものもあります。分子が細孔内外に移動するには時間がかかるため、分子がカラム内を移動するにつれて分析種のバンドは拡散する傾向にあります。ただし、充塡剤の粒子径が小さいほどこのプロセスが速く起こり、分析種のバンド拡散が起こりにくくなります。線速度が大きいと細孔に出入りする分子と移動相と共に流れていく分子の距離が大きくなります。分析種分子を収束させておくには、移動相の線速度を小さくしなければいけません。線速度が大きくなると分析種の分子が分散しバンド拡散が大きくなってしまいます。

van Deemter CurveはA項、B項、C項の3つの項を合わせて構成されます（図25）。この曲線の最も低い点にあたる線速度で分析を行なうと、最も高いカラム効率と分離を得ることができます。

これを図23に示したvan Deemterの式と相関づけて考えると、粒子径が半分になると、理論段高(H)は2分の1になります。すなわち、より小さい粒子径を用いる事でカラム内のバンド拡散を低減できます。

図25：van Deemter Curve
A項、B項、C項の３つを合算して作成。

図26：粒子径10μmと5μmのvan Deemter プロットを比較

例えば図26は、粒子径10μmと5μmのvan Deemterプロットを表したものです。この図からわかるように、粒子径の大きい10μmの充塡剤では線速度に対し、理論段高（H）の最低値（18μm＠0.7mm/秒）を得られる最適な線速度の範囲が極めて狭くなっています。線速度が速すぎたり遅すぎたりすると理論段高（H）が増加し、分離度や感度が低下します。これに対し、5μmの粒子径ではより大きい線速度ではるかに低いH値（10μm＠0.95mm/秒）が得られるだけでなく、理論段高(H)の得られる最適な線速度の範囲も広くなっています。これは、粒子径10μmを充塡したカラムよりも短時間でより高いカラム効率と分離度を実現できることを意味しています。

さらに深く理解するために、粒子径がvan Deemterの式を構成する各項にどのような影響を与えるかについて更に検討します。

粒子径は、A項（多流路拡散）に著しい影響を及ぼします。分析種の分子が移動相から粒子の表面やその周辺に移動する経路は粒子径が小さくなるほど短く、かかる時間も短くなります。粒子径が大きくなると、分析種の分子の移動が長くなり、遠回りの経路を移動することになります。1つのバンド内で分析種の分子の移動時間が異なるため、結果的にバンド拡散が起こり、幅の広いピークになってしまいます。

一方、充塡剤の粒子径が小さくなると分析種の分子同士の移動距離がより近い値となります。結果として得られた幅の狭い分析種のバンドが幅の狭いピークとして検出され、高いカラム効率と感度が実現します（図27）。

図27：粒子径が多流路拡散（A項）に及ぼす影響

B項（軸方向拡散）は粒子径による直接的な影響を受けません。しかしながら、粒子径が小さくなるとvan Deemterの式で表されるA項とC項が小さくなります。結果的に最適線速度が大きくなり、バンド拡散の可能性が低減します。一方、線速度が遅くなると分析種の分子が長時間にわたって充塡剤と相互作用します。これは、移動相中で軸方向（縦方向）の拡散が起こる時間が増えることで、より幅広く拡散した分析種のバンドを生じることを意味しています。線速度が大きければ、分析種の分子がより短時間にカラムを通過するため、より収束した分析種のバンドを維持することができます。軸方向拡散の時間が短いため、狭く効率の高いピークを得る事ができます（図28）。

図28：線速度が軸方向拡散（B項）に及ぼす影響

C項（物質移動）は、線速度と粒子径の両方から影響を受けます。分析種の分子は、移動相から充塡剤粒子表面に移動します。その後、細孔に入って結合相（C₁₈、C₈など）と相互作用した後に細孔から移動相に戻ります。しかしながら、同じ分析種の分子においても個々の分子によって細孔への出入りの程度は異なります。これは、分子が移動相に戻る際個々の分析種の分子が移動する経路の距離に差異が生じ、分析種のバンドの拡散が起こることを意味しています（図29）。どの程度のバンド拡散が起こるかは、線速度によって異なります（図30）

図29：細孔内外への物質移動（C項）

図30：線速度が物質移動および分析種バンドに及ぼす影響（粒子径は同じ）

線速度が大きいと、充塡剤粒子表面と相互作用する分析種の分子と、移動相中に留まって移動する分析種の分子との時間差が大きくなります。移動相の速度が速いほど、分析種の分子はカラムを素早く通過し、結果的に幅広く収束性の低い分析種のバンドを形成します。これは言い換えると、ピークが拡がり感度が低下することを意味します。

一方、線速度が遅ければ、粒子表面との相互作用が起こる時間差が小さくなります。その結果、分析種のバンドの収束性が向上し、より幅が狭く効率の高いピークが得られます。

物質移動は粒子径の二乗（dp²）に比例するため、粒子径を小さくすることで劇的に改善します。粒子径が小さくなると、分析種の分子が細孔に移動し、固定相と相互作用し、移動相に戻る時間が短くなります。このため、粒子径の小さいカラムで分離した場合、よりシャープで幅が狭い、カラム効率の高い分析種のバンドが形成されます（図31）。

図31：粒子径による物質移動（C項）の違い（細孔100Åの例）
粒子径が小さいと幅の狭い分析種バンドが形成される。

粒子径を小さくする事で物質移動を改善し、C項の傾きを効率的に抑え、今日のUPLC テクノロジーを実現しています。図32のvan Deemter プロットでもわかるように、粒子径1.7μmではHETP値が粒子径3.5μmの1/2～1/3になります。また速い線速度で、かつ、より広い速度範囲で低いH値を実現できます。このように、より小さな粒子径を用いる事で物質移動が劇的に改善され効率と分離能が大幅に向上します。より速い線速度でも分離能を損なうことなく、分析のスループットを上げることが可能になります。

図32：粒子径とvan Deemter プロットの相関関係
粒子径5.0μm、3.5μm、1.7μmをvan Deemterプロット上で比較

カラム外（装置由来）のバンド拡散がvan Deemter プロットに及ぼす影響

UPLCが研究施設で広く有効な分析機器として採用されるようになるにつれて、粒子径2μm以下の充塡剤が既存のHPLC粒子径と比べ、どれくらい性能を向上させられるかを判断するための一般的な方法としてvan Deemterプロットが注目されるようになりました。ただし、これらの比較はカラム外バンド拡散を最小化した装置で実施しない限り、理論通りの結果が得られません。

カラム外のバンド拡散が測定に及ぼす影響を実証するため、従来のHPLC装置（バンド拡散＝7.2μL）を用いて、粒子径1.7μmと2.5μmを比較したvan Deemterプロットを作成しました（図33）。両カラムの基材と結合相のケミストリーは全く同じです。一見したところ、このvan Deemterプロットからは二つのカラムの性能に違いはないように見えます。どうしてこのようなことが起こるのでしょうか?

この場合、HPLC装置のバンド拡散により、粒子径1.7μmのUPLCカラムでも粒子径2.5μmのHPLCカラムとほとんど変わらない測定結果になっています。これは、粒子径1.7μmのUPLCカラムにより生成するより狭いピーク幅が、粒子径のより大きい（2.5μm等）充塡剤を充塡したカラムの場合よりカラム外のバンド拡散の影響を大きく受けているためです。この結果、判断を誤らせるような結果が生じていました。

図33：HPLCを用いたvan Deemterプロット（2.5μm vs 1.7μm）
従来のHPLC装置で粒子径1.7μmと2.5μmのカラムを比較評価。性能や線速度範囲はほぼ同
等の結果を示した。
カラム1：XBridge^® HPLC C₁₈、2.1×50mm、2.5μm、
カラム2：ACQUITY UPLC BEH C₁₈、2.1×50mm、1.7μm、サンプル：アセナフテン

今度は、ACQUITY UPLC装置（バンド拡散＝2.8μL）を用いて同じ実験を実施しました。ACQUITY UPLC装置は上記HPLC装置よりもシステムボリュームが約84%、バンド拡散が60%
低減しています。

図34からわかるようにACQUITY UPLC装置で実証した場合、二つのカラムには顕著な違いが見られます。HETPにおける違いだけでなく、最適線速度が3.0mm／秒（粒子径2.5μm）から10.0mm／秒（粒子径1.7μm）に向上しています。これは、UPLC テクノロジーによるHETPの低減（効率の向上）と線速度の増大（ハイスループット化）により性能が向上したことを実証しています。

図34：UPLCを用いたvan Deemterプロット（2.5μm vs 1.7μm）
ACQUITY UPLC装置で粒子径1.7μmと2.5μmのカラムを比較評価。粒子径が小さいほど性
能や線速度の最適範囲が向上。
カラム1：XBridge HPLC C₁₈、2.1×50mm、2.5μm、
カラム2：ACQUITY UPLC BEH C₁₈、2.1×50mm、1.7μm、サンプル：アセナフテン

妥協せずに分離の完全性を維持

カラム外、およびカラム内バンド拡散についてこれまで述べてきました。ここでは、これらの項の表す尺度（HETPと線速度の関係）をより実用的な理論段数と流速の比較という形で説明しましょう。

線速度はカラムを通過する際の移動相の速度を指します。サイズの異なるカラム性能を比較できるよう、カラムの内径に関係なく移動相の流速を標準化したものです。最適線速度は、最適流速に比例します（図35）。従来のHPLCカラムでは、ごく狭い流速範囲でしか最適な性能を実現することができません。この流速範囲外で使用する場合、性能低下が予測されます。

図35：理論段高-線速度および理論段数-流量の相関関係
最適線速度は最適流速に対応し最大限の性能を発揮。値は粒子径1.7μmを充塡した2.1×50mmのカラムで計算。

従来のHPLCで分析時間を短縮する（スループットを向上させる）一般的な方法は、単純に流速を上げる事です。HPLC用の粒子径が大きいカラムを使用している場合、流速を上げると最適線速度を超える速度になり、カラム効率（理論段数）や分離度が著しく失われてしまいます（圧縮されたクロマトグラフィー）。HPLCでは、このようにクロマトグラフィー性能と分析スピードの間で妥協を強いられます（図36）。

図36：HPLCにおける分離度とスピードの間での妥協
ここでは分離度が30%低減。

UPLC テクノロジーでは、このような妥協を行なう必要はありません。クロマトグラフィー性能を犠牲にすることなく、分析時間を短縮することが可能です。粒子径を3.5μmから1.7μmに小さくすると、カラム効率が有意に向上します（図37）。これは、粒子径1.7μmのUPLCカラムではカラム内のバンド拡散が無視できる程度に小さく、幅の狭いバンドが得られるためです。また、高流速においてもカラム効率が向上しています（図37）。これは同じ長さのカラムで、より短い分析時間で劇的にカラム効率が向上し、最適な分離が達成できることを示しています。

図37：最適流速の粒子径依存

カラムにおける分離効率（L/dp）の理解

クロマトグラフィー分離を行なう場合の主な目標は、ある成分を他の成分から分離し、いくつかまたは全ての成分を測定することです。カラムの最大分離効率は、カラムの長さ（L）を粒子径（dp）で割ることによって推定できます。あるアプリケーションに対してどのような粒子径の充塡剤やカラムの長さが必要になるかを判断する場合にL/dp比は特に有効です（図38）。

図38：カラム長/粒子径（L/dp)の算出

この比は、異なるサイズの粒子径に分析法を移管するためのツールとしても利用することが出来ます。L/dp比が30,000（多少困難）のカラムは一般的によく使用されます。図39からわかるように、分離効率30,000を得られる典型的なHPLCカラムは、粒子径5μmを充塡した長さ150mmのカラムになります。粒子径が小さくなれば、より短いカラムで同じ分離効率を得る事ができます（つまり、より高速の分析が可能になります。例えば粒子径1.7μmを充塡した長さ50mmのカラムで分離効率30,000を達成できます）。カラムの長さを短くできることに加え、粒子径が小さくなると最適流速が向上し、更に分析時間を短縮できます。

図39：分離指標の関数としてL/dp比を比較（容易－非常に困難）
同じL/dp比のカラムは同じ分離力。

ここでは、より明確にクロマトグラフィーで実証しています（図40）。粒子径1.7μmを充塡した長さ50mmのUPLCカラムは、粒子径5μmを充塡した長さ150mmのHPLCカラムと同じ分離効率を示します。L/dp比を一定に保つことで、分離能を維持しながら分析時間を1/10に短縮しています。ここでは、それぞれの粒子径に反比例するよう流速を調節しました。また、カラムにロードする負荷量が同じになるようにカラムボリュームに比例して注入量を調節しています。

図40：分離効率（L/dp比）を維持した高速分離の実現
L/dp比を一定にして粒子径を小さくすることで分離を維持した高速化が可能。

UPLC テクノロジーを理解する上で、カラム長／粒子径(L/dp)比の理解は重要なポイントになります。UPLC テクノロジーは、短いカラム(ハイスループットが目的)または長いカラム(高分離が目的)に粒子径が小さく高耐圧な粒子を効率的に充塡した技術です。これらのUPLCカラムはバンド拡散を最低限に抑え、2μ以下の粒子径のカラムを最適線速度で使用できるように設計された装置で使用されています。

グラジエント分離性能の測定（ピークキャパシティ）

アイソクラティック条件下では、理論段数（N）が装置とカラムを併せたバンド拡散の指標になります。バンド幅の拡がりに関連する拡散により、分析種のバンドは固定相に長く保持されるほどバンド幅が拡がります。

グラジエント条件下では、移動相の溶出強度は分析の過程で変化します。このため、強く保持された分析種のバンドがアイソクラティックの場合より速くカラムを通過し（これにより保持時間が変わる）、より収束した（幅の狭い）バンドを維持します。逆相クロマトグラフィーの場合、移動相の溶出強度を増加させることで得られるバンドの幅をコントロールし、結果としてバンドが検出器を通過する際に同様のピーク幅が得られます。移動相の溶出強度を変えることでピーク幅や保持時間が変化するため、理論段数は(ピーク幅によって変化するため)グラジエント条件下では正しく測定されません。

グラジエントでの分離効率はピークキャパシティ（Pc）によって算出できます。ピークキャパシティは簡単に言うと、あるグラジエント時間において分離可能な理論上のピーク数です。ピークキャパシティはピーク幅に反比例するため、Pcを増加させるにはピーク幅を狭くする必要があります。

図41：ピークキャパシティ (Pc)の式： (tg)グラジエント時間、(w)ピーク幅の平均

図42：ピークキャパシティの式を高速分離に適用
グラジエント分析時間0.37分、ピーク幅の平均0.01分、ピークキャパシティは38。13.4%のピーク高さのピーク幅を用いて算出 (4σ)。

UPLC テクノロジーを用いることで、ピークキャパシティを劇的に向上させることができます。UPLC テクノロジーの高い分離効率により、非常に拡散の小さい装置（バンド拡散：2.8μL）で粒子径2μm以下の粒子の性能を最大限に活用し、単位時間あたりにより多くの情報を得ることが可能です。例えば、ホスホリラーゼbのトリプシン消化物の場合、粒子径5μmを充塡したHPLCカラムでは約70のピークの同定に過ぎませんが（図43A）、UPLC テクノロジーでは同定できるピーク数が70から168に増加し、タンパク質同定の信頼性が向上します（図43B）