SPE メソッド開発

SPEはクロマトグラフィーです。

固相抽出はHPLCと同じ基本原理に基づいていることを覚えておいてください。分析対象成分およびマトリックス成分の分離挙動の知識があれば適切な充塡剤および溶離液の選択に役立ちます。例えば、分析対象成分と夾雑成分があるクロマトグラフィー条件できれいに分離することが分かっていれば同じSPE充塡剤と溶離液の組み合わせを選択することができます。同様に、除去しようとしている夾雑物がHPLCで共溶出する場合は同様のSPE条件では上手くいかないことが経験的に分かります。

一般的な溶出プロトコール

目的サンプル成分の分離およびクリーンアップには2つの一般的な方法があります:

• マトリックス中の夾雑物をカートリッジに保持させて目的成分を素通りさせる。
• 目的成分をカートリッジに保持させてマトリックス中の夾雑物を素通りさせる。

目的とするサンプル成分が高濃度で含まれる場合は通常1番目の方法を選択します。目的成分の濃度が低い、あるいは極性が大きく異なる複数成分の分離が必要な場合は一般的に2番目の方法を使用します。非常に低濃度の化合物の微量濃縮および希薄サンプルの濃縮も2番目の方法で行います。

固相抽出法の手順

次のセクションでは全ての固相抽出法に含まれる手順について説明します。多くのアプリケーションは下記のステップ（後で一般例を用いて説明）を1つ以上省略して手順を簡略化することができます。ここに例示された手順は分離を視覚化するために色素を含むサンプルを使用しています。ほとんどのサンプルはある種の検出器あるいは回収されたフラクションの成分を確認するための試験が必要な無色の成分を含んでいることを覚えておいてください。独自に手順を開発する場合、または文献に発表されている手順を変更する場合は以下の情報をガイドラインとしてご利用ください。

1. サンプル調製
2. 固相カートリッジのコンディショニング
3. サンプルロード
4. 脱離

固相抽出［SPE］の主要な分離モード

順相クロマトグラフィー

このモードは化学的性質が低極性から中極性の中性有機化合物の分離に古くから使用されています。

SPEカートリッジを用いた順相クロマトグラフィーは高極性充塡剤と低極性溶媒のステップグラジエントを使用します。

1. カートリッジをホールドアップボリュームの6～10倍量の低極性溶媒でコンディショニングする通常サンプル溶解溶媒と同じ溶媒を使用する
2. サンプル溶液をカートリッジベッドにロードする
3. 低極性溶媒で不要成分を洗浄する
4. 最初の目的成分をより高極性の溶媒で脱離する
5. 段階的により高極性の［脱離力の強い］溶媒で残りの目的成分を脱離する
6. 全ての成分を回収後、使用後のカートリッジを安全かつ適切な方法で廃棄する

この手順について中性で比較的低極性な3種類の有機色素混合物［黄、赤、青］を含むサンプルを用いた例を下図に示しています。カートリッジベッドにロードすると最初は黒色に見えます。 

SPEカートリッジを用いた順相クロマトグラフィーの一般的な使用手順の例
(Silica, Florisil, Alumina, Diol, CN, NH₂)

逆相クロマトグラフィー

水系サンプルは多様でアプリケーションは環境水から果物・野菜、飲料水から生体試料と幅広いことから逆相クロマトグラフィーはSPEの主要モードになっています。 SPEカートリッジを用いた逆相クロマトグラフィーは低極性充塡剤と高極性から中極性溶媒［脱離力の弱い溶媒から強い溶媒へ］のグラジエントを使用します。

1. シリカ系充塡剤またはポリマー充塡剤をホールドアップボリュームの6～10倍量のメタノールまたはアセトニトリルでコンディショニングするホールドアップボリュームの6～10倍量の水または緩衝液で平衡化するカートリッジを乾燥させないよう注意する［Oasis は例外］
2. 高極性溶媒［弱溶媒、一般的には水］に溶解したサンプルをロードする
3. 高極性溶媒で不要成分を洗浄する
4. 保持の弱い目的成分をより低極性の溶媒で脱離する
5. 段階的により低極性の［脱離力の強い］溶媒で保持の強い目的成分を脱離する
6. 全ての成分を回収後、使用後のカートリッジを安全かつ適切な方法で廃棄する

この手順について2種類の高極性食用色素［赤、青］、糖および人工香料を含む水系のグレープ飲料を用いた例を下図に示しています。［本物のグレープジュースではありません］グラスに調製された飲料は色素の濃度が希釈されるため薄い紫色に見えます。 SPEカートリッジにロードすると保持が強い色素が入り口付近に濃い紫色のバンドとして濃縮されます。

SPEカートリッジを用いた逆相クロマトグラフィーの一般的な使用手順の例
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

イオン交換クロマトグラフィー

イオンまたはイオン性化合物は何らかのイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィーで最もよく分離されます。イオン交換クロマトグラフィーは汎用されている順相および逆相クロマトグラフィーとは全く異なる原理に基づく相補的な分離モードで、効果的で選択性の高いサンプル前処理プロトコールを提供します。

2つの主要な官能基タイプ―陰イオンおよび陽イオン交換－の例
反対の電荷を持つ分子を選択的に引き付けて保持する

SPEカートリッジを用いたイオン交換クロマトグラフィーはイオン交換充塡剤とpHまたはイオン強度のグラジエントを使用します。

1. カートリッジをホールドアップボリュームの6～10倍量の脱イオン水または弱い緩衝液でコンディショニングする
2. 脱イオン水または緩衝液に溶解したサンプルをロードする
3. 弱い緩衝液で不要成分および弱く結合している成分を脱離する
4. 最初の目的成分をより強い緩衝液で脱離する（pHまたはイオン強度を変更する）
5. 段階的により強い緩衝液で他の目的成分を脱離する
6. 全ての成分を回収後、使用後のカートリッジを安全かつ適切な方法で廃棄する

この手順についてpKa値が異なる2種類のイオン性色素を含む水溶液サンプルを用いた例を下図に示しています。カートリッジにロードすると青色と黄色の成分は両方とも強く保持されて入り口付近に緑色のバンドとして現れます。

SPEカートリッジを用いたイオン交換クロマトグラフィーの一般的な使用手順の例
(NH_2, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

陽イオン交換および陰イオン交換体は充塡剤表面に結合されているイオン性基の種類によってさらに弱イオン交換体と強イオン交換体に分類されます。強陽イオン交換体は全てのpH範囲において常に解離［負に荷電］するスルホン酸基のような酸性の表面部位をもちます。弱陽イオン交換体は高pHで負に荷電し低pHで分子型になるカルボン酸のような酸性の表面部位をもちます。同様に、強陰イオン交換体は一般的に常に正に荷電する4級アンモニウム基をもち、弱陰イオン交換体は低pHで正に荷電し高pHで分子型になる1級、2級、または3級アミン類をもちます。

各分析対象成分に適切なSPEイオン交換カートリッジタイプを選択するためのガイドラインとして次の表をご使用ください。

ミックスモードイオン交換クロマトグラフィーは逆相モードとイオン交換モードを組み合わせた１つのSPEカートリッジおよび1つのプロトコールで使用します。単一の複雑なマトリックスから中性、酸性、塩基性化合物を分離・抽出するために使用できます。理想的なミックスモードSPE充塡剤は水湿潤性が高く疎水性化合物を逆相に強く保持します。表面上には上記の4つの一般的なタイプのうちの1つのイオン交換基をもちます。適切な脱離力の有機溶媒の混液による洗浄は中性化合物［分子型のイオン性分析対象成分を含む］を分画するために使用されます。分析対象成分［強イオン交換体に結合している場合］または充塡剤［分析対象成分が弱イオン交換体に結合している場合］のいずれか一方の電荷を操作することによってイオン結合した分析対象成分を選択的に溶出させることができます。