La cromatografia in fase inversa che utilizza reagenti di accoppiamento ionico quali TFA e acido formico consente di ottenere separazioni ad alta risoluzione di miscele peptidiche complesse, per esempio digeriti triptici di proteine o lunghi peptidi sintetici, le cui sequenze possono differire per un solo amminoacido. In genere, l'idrofobicità del peptide determina l'ordine di eluizione, in base al quale i peptidi meno idrofobi vengono eluiti per primi.
Fattori quali la composizione delle particelle (silice o ibride), la dimensione dei pori (130 Å o 300 Å), la densità del ligando, nonché le condizioni di separazione (per esempio, durata del gradiente, temperatura di separazione, velocità di flusso), rivestono un ruolo importante nell'ottenere una separazione che soddisfi i requisiti dell'applicazione.
Come per altre bioseparazioni, quando si utilizzano particelle di dimensioni inferiori, le soluzioni delle colonne UPLC/UHPLC offrono, per questa complessa applicazione, una risoluzione di componenti superiore e più rapida rispetto alle colonne basate su HPLC.