基因治療藥物適用的AEX管柱與標準品

基因治療藥物適用的AEX管柱與標準品

為多種基因療法開發基於電荷的方法。Waters AEX管柱提供多種不同的滯留性和選擇性,適合供專門研究合成寡核苷酸、CRISPR基因編輯、mRNA、質體DNA以及病毒載體的藥物開發人員使用。

為多種基因療法開發基於電荷的方法。Waters AEX管柱提供多種不同的滯留性和選擇性,適合供專門研究合成寡核苷酸、CRISPR基因編輯、mRNA、質體DNA以及病毒載體的藥物開發人員使用。


概述

AEX是分離基因治療藥物的基礎技術,這類藥物包括反義寡核苷酸、siRNA、CRISPR單鏈嚮導RNA (sgRNA)、核糖核蛋白複合體、mRNA、DNA質體和病毒蛋白衣。陰離子交換的機制以帶負電荷分析物與帶正電荷固定相之間的靜電交互作用為基準。生物分子的負離子強度越強,吸附於管柱樹脂的程度就會越緊密。移動相的離子強度或pH值發生變化時,分析物會根據電荷密度進行分離和沖提。

按照工作流程需求選擇合適的Waters AEX管柱和標準品,才能確實提供理想的分析條件。



以弱陰離子交換管柱改善分離成效

以弱陰離子交換管柱改善分離成效

進行核酸的陰離子交換HPLC分析時,選擇Waters Gen-Pak FAX (4.6 x 100 mm)管柱能發揮更高的解析度。Gen-Pak FAX管柱含DEAE官能化非孔性樹脂基弱陰離子交換劑,充填2.5 µm顆粒,非常適合分析與微量製備級應用。

  • 弱陰離子交換非孔性聚合物管柱
  • 合成寡核苷酸與核酸的高解析度分離
  • 符合特定應用需求的獨特DEAE選擇性與低滯留性

強陰離子交換管柱,能在更短的時間內發揮出色的解析度

強陰離子交換管柱,能在更短的時間內發揮出色的解析度

Waters Protein-Pak Hi Res Q (4.6 x 100 mm)陰離子交換(IEX)管柱能輔助進行重組蛋白、單株抗體與其他生物化合物的表徵分析作業。與多種傳統多孔性IEX產品相比,這些顆粒的非多孔性和高載量結合能力使帶電物質實現高解析度所需的時間更短。

  • 強陰離子交換非孔性聚合物充填管柱
  • 四級胺配位基,具有高載量結合能力
  • 適用於多種不同的生物分子

網路研討會:關於核酸陰離子交換與粒徑篩析分析方法的全新專業觀點

開發適用於mRNA和AAV分離的AEX和SEC新方法

mRNA疫苗的成功證實核酸藥物確有療效。因此,我們需要更多用於分析方面的表徵分析工具,以利針對穩定性、異質性、藥物設計和結構-功能關係提供更多資訊。AEX和粒徑篩析層析(SEC)技術非常適合用於核酸及其載體的高解析度分離處理。這場網路研討會深入探討更穩定且適用於多種原料藥與樣品類型(包括AAV和mRNA)的平台方法。

開發適用於mRNA和AAV分離的AEX和SEC新方法

mRNA疫苗的成功證實核酸藥物確有療效。因此,我們需要更多用於分析方面的表徵分析工具,以利針對穩定性、異質性、藥物設計和結構-功能關係提供更多資訊。AEX和粒徑篩析層析(SEC)技術非常適合用於核酸及其載體的高解析度分離處理。這場網路研討會深入探討更穩定且適用於多種原料藥與樣品類型(包括AAV和mRNA)的平台方法。



解決方案


WAX之用與不用

WAX之用與不用

在天然條件下,寡核苷酸和長鏈核酸都會有帶負電荷的聚陰離子磷酸鹽主鏈。這一官能基使核酸非常適合使用AEX。Waters Gen-Pak FAX管柱是非孔性2.5 µm弱陰離子交換樹脂,適用於分析從合成寡核苷酸到mRNA的多種核酸。

  • Synthetic Oligonucleotide Separations
  • Oligonucleotide Anion Exchange Separations
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

從SAX到MAX

從SAX到MAX

Protein-Pak Hi Res Q管柱含有一種具備四級胺官能基的非多孔性聚合樹脂,其強陰離子/陽離子交換(SAX)應用範圍相當豐富且廣泛,包括mRNA完整性分析、CRISPR單鏈嚮導RNA (sgRNA)和核糖核蛋白複合體形成、質體DNA蛋白異構體定量,以及病毒載體基因療法空/滿包被分析。

  • Oligonucleotide Anion Exchange Separations
  • Intact mRNA Analysis
  • Evaluating CRISPR Guide RNA and Ribonucleoprotein Complex Formation
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

AEX基準測試適用的寡核苷酸與核酸標準品

AEX基準測試適用的寡核苷酸與核酸標準品

AEX方法是強大的基因治療藥物表徵分析與品質確認工具。隨時備妥與分析物化學性質相似的優質參考物質有助於加快方法開發速度,也能為日後的分析提供認證標準物質。

  • Lipid conjugated ASO
  • siRNA oligonucleotides
  • Single-Guide RNA (sgRNA)
  • DNA Ladder
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

應用

許多例子能證明Gen Pak FAX弱陰離子交換樹脂用於蛋白質、寡核苷酸和核酸能展現出色的解析能力、回收率,以及獨特的選擇性。管柱滯留性較低,因此可以透過調整移動相提升分離處理效果,並且透過讓移動相條件變性的方式為脫胺異構物提供獨特的分離選擇性。

許多例子能證明Gen Pak FAX弱陰離子交換樹脂用於蛋白質、寡核苷酸和核酸能展現出色的解析能力、回收率,以及獨特的選擇性。管柱滯留性較低,因此可以透過調整移動相提升分離處理效果,並且透過讓移動相條件變性的方式為脫胺異構物提供獨特的分離選擇性。


Cas蛋白會與sgRNA形成核糖核蛋白(RNP)複合體。在藥物開發過程中,評估RNP複合作用的效率和強度非常重要。測試相關原料藥的純度也很重要。新方法強調如何以結合陰離子和陽離子交換的方式,根據天然電荷穩定地分離這三種成分。

Cas蛋白會與sgRNA形成核糖核蛋白(RNP)複合體。在藥物開發過程中,評估RNP複合作用的效率和強度非常重要。測試相關原料藥的純度也很重要。新方法強調如何以結合陰離子和陽離子交換的方式,根據天然電荷穩定地分離這三種成分。


AEX提供一種直接量測法,用於在純度檢測中分離和定量質體蛋白異構體。AEX會根據蛋白質體構形中的電荷密度差異,分離超螺旋(SC)、開環(OC)和線性(L)質體。例如,超螺旋DNA的負電荷密度高於較鬆散的開環或線性DNA,因此,與帶正電的Protein-Pak Hi Res Q固定相會產生更強的交互作用。

AEX提供一種直接量測法,用於在純度檢測中分離和定量質體蛋白異構體。AEX會根據蛋白質體構形中的電荷密度差異,分離超螺旋(SC)、開環(OC)和線性(L)質體。例如,超螺旋DNA的負電荷密度高於較鬆散的開環或線性DNA,因此,與帶正電的Protein-Pak Hi Res Q固定相會產生更強的交互作用。


在AAV基因療法等的生物製造過程中,監測病毒蛋白衣中DNA有效載荷的包被效率是非常重要的一環。絕大部分的蛋白衣未必含有理想的轉基因,也不具對應的治療效益。陰離子交換可以根據由載體所含轉基因傳導而增加的負電荷,在功能層面分離空/滿蛋白衣。

在AAV基因療法等的生物製造過程中,監測病毒蛋白衣中DNA有效載荷的包被效率是非常重要的一環。絕大部分的蛋白衣未必含有理想的轉基因,也不具對應的治療效益。陰離子交換可以根據由載體所含轉基因傳導而增加的負電荷,在功能層面分離空/滿蛋白衣。


mRNA蓬勃發展,因此再度迫切需要靈敏穩定的分析方法,以利表徵分析RNA候選藥物和疫苗的生物物理特性。若要進行完整mRNA分析,可以在低溫下採用烷基銨鹽梯度保持mRNA原本的結構,以利在快速測定樣品濃度的同時評估異質性。另也可以將這類技術調整得更加完善,用於監測體外轉錄反應的進行過程。

mRNA蓬勃發展,因此再度迫切需要靈敏穩定的分析方法,以利表徵分析RNA候選藥物和疫苗的生物物理特性。若要進行完整mRNA分析,可以在低溫下採用烷基銨鹽梯度保持mRNA原本的結構,以利在快速測定樣品濃度的同時評估異質性。另也可以將這類技術調整得更加完善,用於監測體外轉錄反應的進行過程。


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數據不證自明

數據不證自明
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Cas9蛋白質複合體形成後,觀察到sgRNA含量略多。在260 nm(黑色)和280 nm(紅色)波長下監測的複合作用。
UV chromatograms (260 nm) obtained for an oligo dT ladder using various AEX columns. Salt gradient separations were performed at 30 ˚C with a 0.72 mL/min flow rate, 20 mM Tris pH 8 buffer mobile phase, and a 10 minute gradient running from 300 to 600 mM NaCl.
使用各種AEX管柱得到的oligo dT ladder的UV層析圖(260 nm)。在30 °C的條件下,以0.72 mL/min的流速,使用20 mM Tris pH 8緩衝液移動相進行鹽梯度分離處理,並以10分鐘梯度將濃度從300 mM NaCl遞增到600mM NaCl
ΦX174 plasmid isoform (L, O, SC) separation on a Waters Protein-Pak Hi Res Q column. 20 mM Tris pH 7.4, 1.69–1.75 M tetramethylammonium chloride in 10 min. Flow rate: 0.4 mL/min.
以Waters Protein-Pak Hi Res Q管柱進行的ΦX174質體蛋白異構體(L、O、SC)分離處理10分鐘內使用20 mM Tris pH值7.4、1.69–1.75 M的四甲基氯化銨。流速:0.4 mL/min.
Quantification of % empty capsid in various empty and full capsid mix using the optimized AEX method.
使用最佳化後的AEX方法定量空蛋白衣在各種空/滿蛋白衣混合物中所佔的百分比。
Ion exchange separations of Cas9 mRNA (A) and EPO mRNA (B) using an AEX column, a Tris buffered mobile phase, and sodium chloride gradient combined with a series of different column temperatures ranging from 30 to 60 °
使用AEX管柱、Tris緩衝液移動相以及氯化鈉梯度,結合一系列範圍介於30~60 °C之間的各種管柱溫度,進行Cas9 mRNA (A)和EPO mRNA (B)的離子交換分離。
Separation of an 18-mer oligonucleotide on the Gen-Pak FAX (WAT015490) highlighting efficient separation of N-1, N+1, and suspected deaminated impurities (X) with an optimized high organic method. Nercessian, L., et al. (2024). Robustness evaluation of weak anion exchange chromatography method for the purity analysis of therapeutic oligonucleotides. Journal of Chromatography A, 1736, 465412.
使用AEX管柱、Tris緩衝液移動相以及氯化鈉梯度,結合一系列範圍介於30~60 °C之間的各種管柱溫度,進行Cas9 mRNA (A)和EPO mRNA (B)的離子交換分離。

網路研討會與資源


  • How-to Video

關於核酸陰離子交換與粒徑篩析分析方法的全新專業觀點

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深入瞭解基因治療藥物適用的AEX管柱與標準品。

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