Columnas y patrones AEX para terapia génica

Columnas y patrones AEX para terapia génica

Desarrolle métodos basados en la carga para una amplia variedad de terapias génicas. Las columnas AEX de Waters proporcionan retención y selectividad versátiles a los desarrolladores de fármacos centrados en oligonucleótidos sintéticos, edición de genes de CRISPR, ARNm, ADN plasmídico y vectores virales.

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Descripción general

El AEX es una técnica fundamental para separar compuestos de terapia génica, incluidos oligonucleótidos antisentido, siRNA, ARN de guía único (sgRNA) de CRISPR, complejos de ribonucleoproteínas, ARNm, plásmidos de ADN y cápsides virales. El mecanismo de intercambio aniónico se basa en las interacciones electrostáticas entre los analitos cargados negativamente y la fase estacionaria cargada positivamente. Cuanto más negativa sea una biomolécula, con más firmeza se adsorbe en la resina de la columna. Los analitos se separan y eluyen en función de la densidad de carga a medida que cambia la fuerza iónica o el pH de la fase móvil.

Garantice unas condiciones óptimas para sus análisis eligiendo la mejor columna AEX y el patrón de Waters para su flujo de trabajo.

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Columnas de intercambio aniónico débil para mejorar las separaciones

Columnas de intercambio aniónico débil para mejorar las separaciones

Las columnas Gen-Pak FAX (4,6 x 100 mm) de Waters ofrecen la mayor resolución disponible en HPLC de intercambio aniónico de ácidos nucleicos. La columna Gen-Pak FAX contiene un intercambiador aniónico débil basado en resina no porosa funcionalizada con DEAE. Contiene partículas de 2,5 μm y sirve para aplicaciones analíticas y micropreparativas.

  • Columnas de polímero no poroso de intercambio aniónico débil
  • Separación de alta resolución de oligonucleótidos sintéticos y ácidos nucleicos
  • Selectividad única de DEAE y baja retención necesarias para aplicaciones específicas

Columnas de intercambio aniónico fuerte para una resolución excepcional en menos tiempo

Columnas de intercambio aniónico fuerte para una resolución excepcional en menos tiempo

La columna de intercambio iónico (IEX) Protein-Pak Hi Res Q (4,6 x 100 mm) de Waters facilita la caracterización de proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales y otros compuestos biológicos. Gracias a la característica no porosa de estas partículas y a su alta capacidad de enlace con compuestos, se obtiene una resolución extraordinaria para las especies con carga en un tiempo menor que el que necesitan muchos de los productos IEX porosos tradicionales.

  • Columnas rellenas de polímero no poroso de intercambio aniónico fuerte
  • Alta capacidad de unión con funcionalidad de ligando de amina cuaternaria
  • Admite una amplia variedad de biomoléculas

Seminario online: New Insights on Anion Exchange and Size Exclusion of Nucleic Acids

Desarrollar nuevos métodos AEX y SEC para las separaciones de ARNm y AAV

El éxito de las vacunas de ARNm demuestra las capacidades de los fármacos basados en ácidos nucleicos. Se necesitan más herramientas de caracterización analítica para proporcionar más información sobre la estabilidad, la heterogeneidad, el diseño de fármacos y las relaciones estructura-función. Las técnicas AEX y de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) son muy adecuadas para obtener separaciones de alta resolución de ácidos nucleicos y sus transportadores. Este seminario online profundiza en un método de plataforma más robusto para múltiples fármacos y tipos de muestra, incluidos los AAV y el ARNm.

Desarrollar nuevos métodos AEX y SEC para las separaciones de ARNm y AAV

El éxito de las vacunas de ARNm demuestra las capacidades de los fármacos basados en ácidos nucleicos. Se necesitan más herramientas de caracterización analítica para proporcionar más información sobre la estabilidad, la heterogeneidad, el diseño de fármacos y las relaciones estructura-función. Las técnicas AEX y de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) son muy adecuadas para obtener separaciones de alta resolución de ácidos nucleicos y sus transportadores. Este seminario online profundiza en un método de plataforma más robusto para múltiples fármacos y tipos de muestra, incluidos los AAV y el ARNm.

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Soluciones

WAX activado, WAX desactivado

WAX activado, WAX desactivado
Columnas Gen-Pak FAX

En condiciones nativas, los oligonucleótidos y los ácidos nucleicos más largos tienen una estructura de fosfato polianiónico cargado negativamente. Esta funcionalidad hace que los ácidos nucleicos sean candidatos ideales para AEX. La columna Gen-Pak FAX de Waters es una resina de intercambio aniónico débil no porosa de 2,5 µm diseñada para ácidos nucleicos que van desde oligonucleótidos sintéticos hasta ARNm.

  • Synthetic Oligonucleotide Separations
  • Oligonucleotide Anion Exchange Separations
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

SAX al máximo

SAX al máximo
Columnas Protein-Pak Hi Res Q

La columna Protein-Pak Hi Res Q contiene una resina polimérica no porosa con funcionalidad de amina cuaternaria. Sus aplicaciones de intercambio aniónico/catiónico fuerte (SAX) son abundantes y de amplio alcance, incluido el análisis de integridad de ARNm, la formación de complejos de ribonucleoproteína y ARN de guía única (sgRNA) de CRISPR, la cuantificación de isoformas de ADN plasmídico y el análisis de encapsidación vacía/completa de terapias génicas con vector viral. 

  • Oligonucleotide Anion Exchange Separations
  • Intact mRNA Analysis
  • Evaluating CRISPR Guide RNA and Ribonucleoprotein Complex Formation
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

Patrones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos para la evaluación comparativa de AEX

Patrones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos para la evaluación comparativa de AEX
Patrones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos

Los métodos AEX son una potente herramienta para la caracterización y la confirmación de la calidad de las terapias génicas. Tener a mano materiales de referencia de calidad que sean químicamente similares a sus analitos puede ayudar a acelerar el desarrollo de métodos y proporcionar una referencia certificada para futuros análisis.

  • Lipid conjugated ASO
  • siRNA oligonucleotides
  • Single-Guide RNA (sgRNA)
  • DNA Ladder
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

Aplicaciones

Hay muchos ejemplos de la resina de intercambio aniónico débil Gen Pak FAX que han demostrado un poder de resolución superior, una mayor recuperación y una selectividad única para proteínas, oligonucleótidos y ácidos nucleicos. La menor retención de la columna permite ajustar la fase móvil para mejorar la separación y lograr una selectividad de separación de isoformas desaminadas única a través de una condición de fase móvil desnaturalizante. 

Hay muchos ejemplos de la resina de intercambio aniónico débil Gen Pak FAX que han demostrado un poder de resolución superior, una mayor recuperación y una selectividad única para proteínas, oligonucleótidos y ácidos nucleicos. La menor retención de la columna permite ajustar la fase móvil para mejorar la separación y lograr una selectividad de separación de isoformas desaminadas única a través de una condición de fase móvil desnaturalizante. 

Notas de aplicación

La proteína Cas forma un complejo de ribonucleoproteína (RNP) con sgRNA. Es fundamental evaluar la eficacia y la fuerza de la complejación de RNP durante el desarrollo de fármacos. También es importante analizar la pureza de los principios activos relacionados. Un nuevo enfoque destaca cómo estos tres componentes se pueden separar fácilmente en función de la carga nativa mediante el acoplamiento del intercambio aniónico y catiónico. 

La proteína Cas forma un complejo de ribonucleoproteína (RNP) con sgRNA. Es fundamental evaluar la eficacia y la fuerza de la complejación de RNP durante el desarrollo de fármacos. También es importante analizar la pureza de los principios activos relacionados. Un nuevo enfoque destaca cómo estos tres componentes se pueden separar fácilmente en función de la carga nativa mediante el acoplamiento del intercambio aniónico y catiónico. 

Notas de aplicación

El AEX proporciona una medición directa para separar y cuantificar las isoformas plasmídicas para las pruebas de pureza. El AEX separa los plásmidos superenrollados (SC), circulares abiertos (OC) y lineales (L) en función de las diferencias en las densidades de carga presentes en la conformación del plásmido. Por ejemplo, el ADN superenrollado tiene una mayor densidad de carga negativa que una forma circular abierta o lineal más relajada, lo que da como resultado una interacción más fuerte con la fase estacionaria cargada positivamente de Protein-Pak Hi Res Q.

El AEX proporciona una medición directa para separar y cuantificar las isoformas plasmídicas para las pruebas de pureza. El AEX separa los plásmidos superenrollados (SC), circulares abiertos (OC) y lineales (L) en función de las diferencias en las densidades de carga presentes en la conformación del plásmido. Por ejemplo, el ADN superenrollado tiene una mayor densidad de carga negativa que una forma circular abierta o lineal más relajada, lo que da como resultado una interacción más fuerte con la fase estacionaria cargada positivamente de Protein-Pak Hi Res Q.

Notas de aplicación

Durante la biofabricación es imprescindible monitorizar la eficacia de encapsulación de la carga de ADN en una cápside viral, como una terapia génica de AAV. Es posible que un alto porcentaje de cápsides no contenga el transgén deseado y no contenga los beneficios terapéuticos correspondientes. El intercambio aniónico puede separar funcionalmente las cápsides vacías y completas en función del aumento de la carga negativa impartida por los transgenes presentes en el vector. 

Durante la biofabricación es imprescindible monitorizar la eficacia de encapsulación de la carga de ADN en una cápside viral, como una terapia génica de AAV. Es posible que un alto porcentaje de cápsides no contenga el transgén deseado y no contenga los beneficios terapéuticos correspondientes. El intercambio aniónico puede separar funcionalmente las cápsides vacías y completas en función del aumento de la carga negativa impartida por los transgenes presentes en el vector. 

Notas de aplicación

El renacimiento del ARNm ha dado lugar a una necesidad renovada de métodos analíticos sensibles y robustos para caracterizar las propiedades biofísicas de los candidatos a vacunas y fármacos de ARN. Para el análisis de ARNm intacto, se puede emplear un gradiente de sales de alquilamonio a baja temperatura para preservar la estructura propia del ARNm, lo que permite evaluar la heterogeneidad junto con una determinación rápida de la concentración de la muestra. Estas técnicas también se pueden optimizar para supervisar el progreso de una reacción de transcripción in vitro.

El renacimiento del ARNm ha dado lugar a una necesidad renovada de métodos analíticos sensibles y robustos para caracterizar las propiedades biofísicas de los candidatos a vacunas y fármacos de ARN. Para el análisis de ARNm intacto, se puede emplear un gradiente de sales de alquilamonio a baja temperatura para preservar la estructura propia del ARNm, lo que permite evaluar la heterogeneidad junto con una determinación rápida de la concentración de la muestra. Estas técnicas también se pueden optimizar para supervisar el progreso de una reacción de transcripción in vitro.

Notas de aplicación

Los datos hablan por sí solos

Los datos hablan por sí solos
Se observó que el sgRNA estaba presente en un ligero exceso después de la formación de complejos con la proteína Cas9. La complejación se supervisó tanto a 260 nm (negro) como a 280 nm (rojo).
Cromatogramas UV (260 nm) obtenidos para una escalera de oligo dT utilizando varias columnas AEX. Las separaciones en gradiente de sales se realizaron a 30 ˚C con un caudal de 0,72 mL/min, fase móvil con tampón Tris de 20 mM a pH 8 y un gradiente de 10 minutos que va desde NaCl de 300 mM a 600 mM.
Separación de las isoformas plasmídicas ΦX174 (L, O, SC) en una columna Protein-Pak Hi Res Q de Waters. Tris de 20 mM a pH 7,4, 1,69-1,75 M de cloruro de tetrametilamonio en 10 min. Caudal: 0,4 mL/min.
Cuantificación del % de cápside vacía en varias mezclas de cápside vacía y completa mediante el método AEX optimizado. 
Separaciones por intercambio iónico de ARNm de Cas9 (A) y ARNm de EPO (B) utilizando una columna AEX, una fase móvil con tampón Tris y un gradiente de cloruro de sodio combinado con una serie de temperaturas de columna diferentes entre 30 y 60 °C.
Separaciones por intercambio iónico de ARNm de Cas9 (A) y ARNm de EPO (B) utilizando una columna AEX, una fase móvil con tampón Tris y un gradiente de cloruro de sodio combinado con una serie de temperaturas de columna diferentes entre 30 y 60 °C.

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