臨床研究のための血漿中三環系抗うつ薬の分析

マルチチューブボルテックスミキサーにチューブを配置し、1,500 rpm で 3 分間ボルテックス混合してから、16,100 g で 2 分間遠心分離しました。上清 25 µL を 1 mL の 96 ウェルプレートに移し、水を 475 µL 加えました。プレートに蓋をして、1,500 rpm で 2 分間ボルテックス混合してから分析しました。

実行時間：4.0 分（注入間時間 4.5 分）

高濃度血漿サンプルから後続のブランク注入に、顕著なキャリーオーバーは見られませんでした。この高濃度サンプルには、500 ng/mL のアミトリプチリン、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、マプロチリン、ノルクロミプラミン、ノルドキセピン、ノルトリミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、1000 ng/mL のノルマプロチリン、トリミプラミン、2500 ng/mL のクロザピン、ノルクロザピンが含まれていました。高濃度サンプルの 1:5 希釈を行ったところ、すべての分析種の平均 % バイアスが 10% 未満になりました。

TCA を低濃度および高濃度でスパイクした内因性化合物（アルブミン、ビリルビン、コレステロール、クレアチニン、トリグリセリド、尿酸）とともに分析しても、有意な干渉は見られませんでした。これについては、低濃度（QC₁）および高濃度（QC₃）でプールした血漿サンプルからの回収率（n = 3）を決定することで評価しました。低濃度および高濃度のプールにおける回収率は 15% 以内でした。ただし、アミトリプチリン、クロミプラミン、クロザピン、イミプラミン、ノルクロミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミンは、低濃度サンプルでトリグリセリドからの干渉（17%）を多少受けていました。

5 日間にわたって血漿中に調製した 4 濃度の低濃度サンプルを 10 回繰り返し抽出・定量することで、分析感度試験を行いました（n = 40）。得られた結果から、この分析法では、下の表 5 に示す濃度で正確な定量（≤ 20% CV、≤15% バイアス）が可能であることが実証されました。

合計精度は、連続しない 5 日間にわたって 3 濃度レベルの血漿プールを 5 回繰り返しで抽出・定量することによって決定しました（n = 25）。各レベルの QC 試料を 5 回繰り返し分析することによって併行精度を評価しました。図 3 に示した結果には、すべての分析種について 3 濃度レベル（25、75、400 ng/mL）で評価した合計精度と併行精度が示されており、50、150、800 ng/mL のノルマプロチリンとトリミプラミン、および 125、375、2,000 ng/mL で評価したクロザピン、ノルクロザピンを除き、≤8.0% CV でした。

マトリックス効果の調査を、低（QC₁）濃度および高（QC₃）濃度のドナーからのヒト血漿サンプル（n = 6）を使用して行い、同等の濃度になるようにスパイクした抽出溶媒サンプルの割合として評価しました。表 6 に示すように、分析種：内部標準レスポンス比を使用したマトリックス係数の計算により、生じているシグナルの増強または抑制はすべて内部標準によって補正されていることが実証されました。

下の表 7 に示すように、この分析法ではすべての分析種について良好な直線性が見られました。分析種の低濃度および高濃度のプールをさまざまな比率で組み合わせて分析することで、この点を評価しました。さらに、検量線では、すべての分析種について、決定係数（r²）0.995 超でした。

正確性は、スキームに含まれていなかったプロトリプチリンを除くすべての分析種について、LGC（英国、大ロンドン）から提供された外部品質保証（EQA）血清サンプルを使用して評価しました。得られた結果を、サンプルの LC-MS 分析法での平均と比較しました。ブランド-アルトマン分析での一致性（図 4）により、分析法の平均バイアスが 14.75% 未満であり、ノルクロミプラミンを除く評価した分析種について、EQA LC-MS での平均値と非常に良く一致することが実証されました。結果のサマリーを表 8 に示します。