バイオ医薬品ラボに広く導入できる柔軟性の高い LC プラットホームとしての Waters ACQUITY Premier システムの評価

業界全体にわたる分析ラボへの需要の増大により、生産性を高めるために LC プラットホームを効率的に利用する必要があります。この試験では、Waters ACQUITY Premier システムの幅広い LC 技術との適合性を評価し、バイオ医薬品ラボを支援するために広く導入可能なLC プラットホームとしてのその適用性を判定します。具体的には、すでに確立されている技法に対する補完的な技法として、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用のクロマトグラフィー技法を評価し、MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）テクノロジーによる性能向上を実証します。この試験では、ACQUITY Premier システムが、高イオン強度の移動相を取り入れた分析法と適合性があり、高度な適合性で確立された分析法を高度の信頼性で実行でき、LC プラットホーム間での分析法移管が容易になることを実証します。要約すると、MaxPeak HPS テクノロジーを採用した Waters ACQUITY Premier システムは、複数のラボにわたって広く導入でき、バイオ医薬品の開発および製造での分析ニーズに対応できる、柔軟な LC プラットホームを提供します。  

アプリケーションのメリット

• ACQUITY Premier システムは、高イオン強度の移動相との適合性を提供する
• MaxPeak HPS テクノロジーは、バイオ医薬品ラボに広く導入できる
• ACQUITY Premier システムは、既存のプラットホームと同等の性能を提供し、分析法移管が容易になる

バイオ医薬品の開発および製造において、生体分子の特性解析およびモニタリングを実施するために、複数の技法にわたる相補的なメソッドを採用することが必要になることがよくあります。パイプラインでの役割を果たすため、生産性に対する要求が高まっていることから、効率的に利用でき、組織全体にわたって使用されている技法との広範な適合性を備えた LC プラットホームがラボに必要です。最近ウォーターズは、MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）テクノロジーを特徴とする ACQUITY Premier システムを導入しました。MaxPeak HPS テクノロジーは、分析種/表面間相互作用に起因する吸着による損失を低減するように設計されており、RPLC、HILIC、IP-RPLC などの技法を使用して、金属の影響を受けやすい分析種についてのクロマトグラフィー性能を改善し、生体分子の分析に有効であることが証明されています^1-3。これらの技法で確立された実証可能な性能向上では、より広範な LC ベースの技法の状況で ACQUITY Premier システムがどのように機能するかという疑問が生じます。より具体的には、バイオ医薬品では、開発および製造の活動の一環として、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEX）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）などの高イオン強度移動相を取り入れた分析法がよく使用されます。この試験の目標は、バイオ医薬品の特性解析および製造での分析ニーズに対応するために、ACQUITY Premier システムを複数のラボにわたって広く導入できる柔軟な LC プラットホームとして評価することです。  

この試験の目的は、ACQUITY Premier システムが高イオン強度の移動相を取り入れた分析法と適合するか、およびこれらの条件下でのクロマトグラフィー性能の観点から、MaxPeak HPS テクノロジーがさらなる利点をもたらすかを判定することです。そのため、ACQUITY Premier システムではまだ評価されていない、バイオ医薬品業界で一般的に使用される代表的な技法として、IEX、SEC、HIC ベースの分析法を選択しました。この試験では、同等の ACQUITY Premier システムで同じ分析法を使用する場合との比較検討を容易にするために、従来の ACQUITY UPLC システムを用いてベースライン性能を確立しました。

イオン交換クロマトグラフィー（IEX）

IEX は、バイオ医薬品の構造と電荷プロファイルを把握するために、業界で一般的に使用される技法です。この技法は塩または pH のグラジエントを使用して導入し、陰イオン性電荷バリアントおよび/または陽イオン性電荷バリアントを分離することができ、「弱」および「強」の形式で使用できます。IEX は、その多用途性、および不純物プロファイリングの技法としての一般的用途から、開発および製造活動に対応するために組織全体にわたって広く導入することができる LC プラットホームとしての、ACQUITY Premier システムの柔軟性を評価する目的に、理想的な候補です。この試験では、市販のモノクローナル抗体ベースの治療薬であるセツキシマブを、20 mM HEPES 中に調製した塩グラジエントを使用して IEX 条件下で分析しました。20 mM HEPES（pH 6.7）中に調製した 25 ～ 65 mM NaCl からの最適化したグラジエントを使用して、Waters BioResolve SCX mAb カラム（製品番号 186009058）で分離しました。図 1A に示されているように、定性的には、ACQUITY Premier システムは、従来の LC システムと同じ忠実性で電荷プロファイルを分離できました。定量的な観点からクロマトグラムをさらに検討すると（図 1B）、保持時間（RT）、分離度（p/v）、ピークキャパシティに関して、両者の分離が統計的に区別できないことが示されています。ACQUITY Premier システムが同等の性能を示すことは、MES バッファーおよび Waters IonHance CX-MS pH バッファー（製品番号 176004498）を使用した場合の pH グラジエントでの分離でも認められました（データは示されていません）。これらの初期の結果により、ACQUITY Premier システムが従来の装置と同等の性能を発揮し、バイオ医薬品ラボに展開された LC 技法に関してより広範な適用性を提供するプラットホームであることが示されています。

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）

SEC は、アイソクラティック条件下で実行され、固定相の多孔性ネットワークへのアクセスしやすさを利用して分析種のサイズに基づいて効率的に分離する点で独特の技法です。この技法は、「適合のある」または非変性の移動相を用いて実行して、凝集体や分解物などの製品/プロセス関連の不純物に関する情報が得られるため、バイオ医薬品に有用であることが証明されています。アイソクラティック分析法として、SEC を使用して分析された分析種は、注入から検出まで連続した流れの下にあり、固定相に吸収されません。この点で、SEC は、ピーク形状と全体的な性能に影響を及ぼす可能性のある吸着現象に対する感度が強化されており、MaxPeak HPS テクノロジーが従来の LC プラットホームよりも優れているかを判定するのに理想的なテストケースです。これを判定するため、ヒト化 NIST モノクローナル抗体 RM8671 および IdeS 消化した非還元型 NIST モノクローナル抗体のフラグメントで構成される Waters モノクローナル抗体サイズバリアント標準試料（製品番号 186009429）を、ACQUITY Protein BEH SEC カラム（製品番号 186008471）を使用して分析しました。分析は、業界で一般的なアイソクラティック条件（50 mM Na₂HPO₄/200 mM KCl、pH 6.9）を使用して流速 0.300 ml/分で実施しました。図 2A に示されているように、ACQUITY Premier システムでは、従来の LC プラットホームと比較して、全体的なプロファイルの点で同等の性能が得られることが観察されました。その一方で、ピークバレー比（p/v）が 34% 向上し（1.41:1.90）、「切断」分子種のネイティブピークからの分離（挿入図）の向上が示されています。高分子種（HMWS）および低分子種（LMWS）の分離度は統計的に同じと判定されたため、観察された性能の向上は、標準試料に固有である可能性があることに、注意する必要があります。ただし、全体的には、MaxPeak HPS テクノロジーは従来の LC ハードウェアを使用する既存の分析法の大部分とは互換性があり、その一方でバイオ医薬品の開発および製造に展開された SEC 技法に、場合によってはさらなる利点をもたらす可能性が、データから示唆されます。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）

HIC は、抗体薬物複合体（ADC）の重要特性の測定に頻繁に使用される技法です。HIC は、非変性分析法として、システインと結合した ADC の薬物分布プロファイルを保持し、治療上の安全性と有効性の評価に使用される薬物抗体比（DAR）の値の正確な測定を可能にします。高イオン強度のグラジエントに依存するこの技法は、より厳しい条件下で ACQUITY Premier システムの性能を評価するための理想的なテストケースになります。この試験では、Waters Protein-Pak Hi Res HIC カラム（製品番号 186007583）で、硫酸アンモニウムで調製した 10 分間の高イオン強度（2 M）グラジエントを使用して、ADC サロゲートを分析しました。図 3A に示されているように、ACQUITY Premier システムを使用して得られたクロマトグラフィープロファイルは、従来の LC システムで得られたプロファイルとよく一致しています。個々のピーク面積を詳細に調べると、破線で示されているように、3 回の繰り返しの標準偏差に基づいて、分離は相互に統計的に識別できないことが実証されます（図 3B）。これらの結果から、ACQUITY Premier システムは過酷な条件下で高い再現性で実行することができ、従来の LC システムと同等の性能を発揮して、プラットホーム間での分析法移管を簡単にすることができることが実証されています。 

Waters ACQUITY Premier システムがバイオ医薬品業界で一般的に使用されている広範な技法に適合していることが、この試験で評価したアプリケーション（IEX、SEC、HIC）で達成された、既存のプラットホームと同等の性能によって、明確に実証されています。定量的結果は両 LC プラットホーム間でほとんど区別できず、従来の分析法の分析法移管が可能であることが示唆されました。この試験では、MaxPeak HPS テクノロジーは、高イオン強度の移動相を取り入れた技法の特定の利点は得られませんでしたが、この結果は、移動相のイオン強度によって分析種/表面の吸着現象が緩和される可能性があることから、予想外ではありませんでした。より重要なこととして、MaxPeak HPS テクノロジーを採用した Waters ACQUITY Premier システムにより、バイオ医薬品の特性解析、開発、製造での分析ニーズに対応するために、世界中のラボに広く展開できる柔軟な LC プラットホームが提供されます。  

1. Birdsall, R. E., Kellett, J., Ippoliti, S., Ranbaduge, N., Shion, H., Yu, Y. Q. Increasing Chromatographic Performance of Acidic Peptides in RPLC-MS-Based Assays with ACQUITY Premier Featuring MaxPeak HPS Technology.Waters Application Note 720007003, 2020.
2. Koshel, B. M., Birdsall, R. E., Yu, Y. Q. Improving Recovery and Quantitation of Oligonucleotide Impurities Using ACQUITY Premier with MaxPeak HPS Technology.Waters Application Note 720007238 2021.
3. Kellett, J., Birdsall, R.E., Yu, Y.Q. Increasing Recovery of Phosphorylated Peptides Using ACQUITY Premier Technology Featuring MaxPeak High Performance Surfaces.Waters Application Note, 720007198 2021.