サイズ排除クロマトグラフィーにおいて長期保管時にカラム性能を維持するためのベストプラクティス

BioResolve SEC mAb カラムの導入にともない、出荷時封入溶媒/保管用溶媒が新たに最適化されました。BioResolve SEC mAb カラムおよび Waters mAb サイズバリアント標準試料を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムの 5 種類の長期保管用溶媒について調査しました。5 種類の被験溶媒のいずれかの中で 1 ヶ月、2 ヶ月、4 ヶ月保管した後、カラム性能のモニタリングを行いました。保管後の各カラムの性能を当初の性能と比較しました。ルーチンでモニタリングが行われているタンパク質凝集体および自己会合型（高分子種、HMWS）の重要品質特性に直接関連するデータを、100 kDa 未満の低分子種（LMWS）の特性解析のデータと共に示しています。

この調査の結果から、バッファーおよび塩を含む保管用溶媒中では、バッファーおよび塩を含まない同様の水性有機溶媒よりも、当初のカラム性能がより良好に維持されることが示されました。塩素を含むバッファー中でのカラムの保管における問題に対処しました。

アプリケーションのメリット

• データにより、BEH ベースの SEC カラムで使用されている 316 ステンレススチール製カラムフリットに対して、10% アセトニトリル/25 mM リン酸ナトリウム（pH 7）、100 mM 塩化カリウムが非腐食性であることが確認されました。
• 結果から、カラムの長期保管には 20% メタノール/80% 水よりも 10% アセトニトリル/25 mM リン酸ナトリウム（pH 7）、100 mM 塩化カリウムの方が適していることが裏付けられました。
• データから、SEC カラムの保管後の性能に影響を与える要因についての知見が得られました。

SEC において、天然のペプチドおよびタンパク質の特性解析に使用する移動相に微生物が増殖し、それがカラムを汚染して、カラムの分離能の低下を引き起こす場合があることは良く知られています。更に、微生物に汚染されたカラムを用いると、フラクションの汚染が発生することが知られています。天然のペプチドおよびタンパク質の特性解析に使用する移動相が、微生物の増殖を促進する pH および塩濃度の範囲内にあることはあまり知られていません^1,2,3。

SEC カラムのメーカーのほとんどは、SEC カラムの出荷および保管用の静菌剤としてアジ化ナトリウムを使用しています。通常使用される濃度は 0.02 ～ 0.05% で、最高推奨濃度は 0.1% です。0.05% というアジ化ナトリウム濃度は、多くのグラム陰性菌に対する殺菌効果が高いことが分かっています⁴。 グラム陽性菌はアジ化ナトリウムへの耐性が強く、1% アジ化ナトリウムを含む培地で増殖することが分かっています⁵。 引用した論文など^6,7から、SEC の条件で微生物の増殖を防ぐのに適した「特効薬」はないことがわかります。バクテリアは、DNA の水平伝播（プラスミド）によって迅速に変化することができるため、ストレス因子に適応できるようになります。最も初期の例を挙げると、ペニシリンの量産開始のわずか 4 年後（1947）に、最初のペニシリン耐性の Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）株が発見されています。微生物汚染による SEC カラムの損傷に対する最善の対処法は予防です。他のカラム汚染のモードとは異なり、保管しているカラムが未使用でも、静菌剤や殺菌剤を含んでいないと微生物が増殖し続ける場合があります。

アジ化ナトリウムの使用に関連したリスクがあるため、この文章の執筆時点において、ウォーターズコーポレーションの全製造施設で、アジ化ナトリウムの使用を拒否/禁止しています。アジ化ナトリウムは、急性毒性が非常に高く、水溶性の高い無機塩類です（RTECS #VY8050000）⁸。 飲み込んだ場合、少量でも死に至る可能性があり⁹ 、解毒剤は見つかっていません¹⁰。アジ化ナトリウムを酸と混合すると、毒性の高いアジ化水素ガスが発生し、配管システムの銅、鉛、黄銅、はんだとの接触により、爆発性の金属アジドの形成および集積につながる場合があります¹¹。

このような理由から、ウォーターズでは、SEC カラム保管中の微生物の増殖を排除/最小化するために、20% メタノール/80% 水、または 10% アセトニトリル（ACN）含有の 25 mM リン酸ナトリウム（Na-PO₄）（pH 7）、100 mM 塩化カリウム（KCl）を静菌剤として使用することにしました。この溶液の従来の使用歴からすると¹²、これらの溶液は、SEC カラムを微生物の増殖から保護する上で、アジ化ナトリウムと同様に有効と考えられます。問題解決に有用な有機溶媒耐性（OST）微生物の探索の結果、OST 微生物は検出が困難であることがわかりました。アセトニトリル耐性のある株が同定できたことから、このバクテリアは、10% ACN によって、増殖の初期段階で死滅することが分かりました⁶。

SEC カラムの保管プロトコルの目的は、短期間および/または長期間休止している間、カラムの現状のクロマトグラフィー性能を維持することにあります。保管後に見られる一般的な問題として、タンパク質の保持時間の変化、HMWS の回収率の不良および/またはカラムの分離能の低下が挙げられます。この調査の目的は、新しい出荷時封入溶媒/保管用溶媒に用いられる、10% アセトニトリル（ACN）含有 25 mM Na-PO₄ （pH 7）、100 mM KCl 選択に対する実験的裏付けを得ることにあります。 

pH 7 未満のバッファーを用いる SEC カラムでは、タンパク質の保持時間の変化は、通常はわずかです。カラム保管に関連するその他の一般的な問題は、望ましくはないものの、通常は、Waters BEH200 SEC タンパク質標準試料混合液（製品番号：186006518）などのタンパク質サンプルの注入により、カラムの再コンディショニングまたは「再不動態化」することで緩和することができます。カラム保管中の壊滅的な事故の原因のうち最も重要な要因は、微生物の増殖です。このアプリケーションノートでは、この事故モードについては直接取り扱いませんが、ウォーターズのラボでのこれまでの使用経験に基づき、低濃度の有機溶媒で、ひどい汚染の見られない SEC カラムにおける微生物の増殖リスクを効果的に軽減することができました。このアプリケーションノートの目的は、BioResolve SEC mAb カラムを 1 ～ 4 ヶ月保管した後に、長期保管用溶媒がカラムの性能に与えた影響を確認することです。

長期保管のデータに進む前に、以下は、短期保管中にカラム性能を維持するための一般的なガイダンスです。

• 冷蔵状態（冷凍ではない）で保管する際には、カラムの末端プラグをしっかりと装着し、バッファーおよび/または塩の析出の原因となる溶媒/バッファーの蒸発を防ぐようにします。更に、酸素に触れると微生物の増殖が促進されます⁴。 冷蔵庫で 4 ℃ で保管する場合にも、保管用溶媒に静菌剤を添加することを強く推奨します。短期間保管用溶媒を正しく選択するには、お使いのカラムの使用マニュアルを参照してください。

• サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によるサンプル分析は、ほとんどとは言えませんが、多くの場合 SEC カラムを高純度滅菌水でパージすることから開始します（これは今でも優れた操作ステップです）。ただし、使用する水の量はカラム容量（CV）の 10 倍より少なく制限する必要があります。100% Milli-Q 水で過剰にパージ（200 CV）すると、高分子種（HMWS）の回収率が低下する可能性があります。図 1 を参照してください。

• SEC カラムを LC システムで、pH 5 ～ 8 のバッファー中で送液なしの条件で保管する際には、必ず静菌剤を使用してください。カラムの保管時に増殖が促進される条件が整うと、1 コロニー形成単位（CFU）がすぐに数百万 CFU に増殖します²。カラムとシステムの両方で送液を停止するより、カラムで低流速を保つ方が望ましいと言えます¹³。ただし、移動相およびシステムに微生物が繁殖していない状態であることが条件となります。

• 微生物により代謝物が産生され、それが微生物の生存/増殖を促進することが知られています^2,4。 次の接種前に微生物を「洗い流す」試験により、過酷な環境下では生存の可能性が低くなることが示されました^2,4。 システム上のカラムをあまり頻繁に使用しない期間、短期間低流速を保っておくことで、バクテリアが急増殖期に入るのを最小限に抑えることができます。この方法は、システムおよび移動相に微生物が存在しない場合にのみ有用で、保管用溶媒に静菌剤を使用せず、送液なしの条件で短期間カラムを保管する場合に望ましい方法です。

サンプルの説明

Waters mAb サイズバリアント標準試料（製品番号：186009429）には 160 μg の安定化して凍結乾燥した NISTmAb RM8671 が含まれており、これには 2 μg の非還元 IdeS（Fabricator）消化 NISTmAb フラグメント（F(ab')₂ および (Fc/2)₂）が添加されています。各バイアルの凍結乾燥した内容物は、70 μL の Milli-Q 水を使用して溶解しました。Waters mAb サイズバリアント標準試料についての詳細は、waters.com で 720006811EN を検索してください。

カラム保管用溶媒の種類が SEC カラムに及ぼす影響を比較した文献はほとんどありません。この内容を扱った唯一の論文では、保管用溶媒として 100% メタノール、10% メタノール、および 0.001% アジ化ナトリウム水溶液を比較しています¹⁴。 100% メタノール溶媒により、検討した SEC カラムのコンディショニングに以前に使用したペプチドが除去されることがわかりました¹⁴。 大半の SEC カラムメーカーの操作マニュアルでは、アジ化ナトリウムを含むバッファーおよび低有機/水溶媒溶液の使用がサポートされていることが記載されています。BioResolve SEC mAb カラムで唯一推奨されている出荷時封入溶媒/保管用溶媒は、10% アセトニトリル溶液にバッファーと塩を添加したものです。

この試験では、10% アセトニトリル水溶液と、塩を含むまたは含まないバッファーの組み合わせによる影響を調べました。塩素を含む保管用溶媒を使用することに対する懸念は複数の腐食試験で解決しました。以前に推奨されていた保管/出荷時封入溶媒溶媒（20% メタノール水溶液）との比較を行っています。BioResolve SEC mAb、200 Å、2.5 µm 4.6 × 150 mm カラムでの使用について比較した 5 種の保管/出荷時封入溶媒：

A：10% アセトニトリル/90% 25 mM Na-PO₄、pH 7.0、100 mM KCl

B：10% アセトニトリル/90% 2.5 mM Na-PO₄、pH 7.0、10 mM KCl

C：10% アセトニトリル/90% 20 mM Na-PO₄、pH 6.8

D：10% アセトニトリル/90% Milli-Q 水

E：20% メタノール/80% Milli-Q 水

この試験では、計 15 本のカラムに充塡し、50 mM Na-PO₄、pH 7.0、200 mM KCl 移動相と、Waters mAb サイズバリアント標準試料（製品番号：186009429）を用いて試験しました。15 本のカラムすべてについて最初の試験を行った後、カラム 3 本ずつのセットに対し、上記の 5 種の保管用溶媒を用いてカラム容量（CV）の 10 倍でフラッシュ洗浄を行いました。15 本のカラムで最初の試験を行った後、それぞれの保管用溶媒グループのうち 1 本ずつのカラムについて、室温で 1 ヶ月、2 ヶ月、4 ヶ月の保管後に再試験を行いました。

Waters mAb サイズバリアント標準試料には、調製されたロットごとに分析証明書が添付されています。この標準試料は、NISTmAb 標準物質（RM）8671（ヒト化モノクローナル抗体）、および NIST RM 8671 に内在する IdeS フラグメントである LMWS1 および LMWS4 とそれぞれ同程度の分子量の 2 種のモノクローナル抗体フラグメントである非還元 IdeS 消化 NISTmAb フラグメント （LMWS2（約 100,000 Da）と LMWS3（約 50,000 Da））で構成されています。Waters mAb サイズバリアント標準試料および NIST RM 8671 のクロマトグラムの例を図 2 に示します。詳細については、720006811EN をご覧ください。

調査した保管用溶媒すべてで、カラム性能が最大 1 ヶ月は変化せず維持されていました。4 ヶ月間におよぶ試験の間にモニターした Waters Empower クロマトグラフィーデータシステムのパラメーターの大半に大きな変化は見られませんでした。すべての溶媒グループにおいて、メインピークの保持時間で軽度の変化が認められました（0.2 分未満）。すべての溶媒で、保持がわずかに増加しており、そのまま 2 ヶ月後まで安定していました。このようなわずかな変化は、ルーチンのカラム使用で、短い期間に発生すると考えられます。

高分子種

Empower クロマトグラフィーパラメーターのうち、大きな変化が見られたものを図 3 に示します。HMWS の面積比は、バッファーおよび/または塩を含まない溶媒中での 1 ヶ月間の保管後も減少を続けました（図 3a）。ダイマーのメインピークの分離度（半値幅 USP 分離度、USP Res. HH）もこのバッファー/塩を含まない溶媒中で、時間の経過とともに減少を続けました。10% アセトニトリル水溶液と、10% アセトニトリル水溶液にバッファーと塩が含まれる場合とが対照的であるのが興味深い点です（図 4）。10% アセトニトリル水溶液では 4 ヶ月後に HMWS の最大の減少が見られました。この結果は以前の試験結果（データは示しません）と一致しており、大容量（10 CV 以上）の 20% メタノール/80% 水でカラムをパージした場合に、同様の効果が見られました。BioResolve SEC mAb カラムの保管用溶媒の抗菌剤にメタノールを選択しませんでした。これは、過去に未知の低レベルの不純物により、カラム性能が悪影響を受けたためです。

低分子種

図 3c および 3d は、LMWS1&2 の面積比およびメインピークからの分離度に対する保管用溶媒の影響を示しています。メインピークからの分離度が低下した結果、LMWS1&2 の面積比が増加しています。分離度が低下すると、メインピークの面積が増加することで、LMWS1&2 の面積比の増加が認められました。この分離度は、Empower パラメーターである LMWS1&2 の開始ピークから谷の高さの比（開始 p/v）を用いてモニターしました。これは、より一般的に使用されるパラメーター（USP Res.HH）が計算できなかったためです。ここでも、バッファーと塩を含まない保管用溶媒では、約 2 ヶ月の保管期間後にカラムの当初の開始 p/v が維持されていませんでした。 

腐食試験

ステンレススチール（SS）は特殊な合金であり、耐腐食性があります。Waters SEC カラムの流路に使用されているスチールのコンポーネントはすべてオーステナイト系 316 SS です。このスチールは耐腐食性を持たせるように作られています。水溶液中のステンレススチールの腐食は、pH、ハロゲン化物（塩素）および/または硫化物の濃度、および温度によって決まります。低 pH、高塩素濃度、高温により、SS の腐食率が高くなります。SEC で使用する塩化物塩を含むバッファーを用いることにより、SS の部品の錆が懸念されます。錆（酸化鉄）は鉄の酸化物として生成します。鉄が水および酸素と結合することで、不溶性の赤茶色の酸化水酸化鉄が生じます。

LC システムや塩酸（HCl）を使用するカラムで錆が生じるリスクについては良く知られています。HCl は、多様な種類のスチールの耐孔食性をランク付けするためによく使用されます。塩酸の強力な性質は、酸性環境と塩化物イオンの複合効果によるものです。試験した 5 種の保管用溶媒すべてがそうであるように、pH が SEC での使用範囲内（pH 5 ～ 8）である場合、腐食の状況は大きく異なります。金属表面に保持されている金属酸化物/水酸化物の層により、攻撃から保護されるためです。これらの層は、酸性条件ではすぐに溶解します。

豊富な経験に基づき、カラムで最も錆が生じやすい部位はフリットであることが分かっています。これは、カラムのチューブ壁と比較して表面積が広く、カラムインレットおよびアウトレットでの酸素レベルが高いためです。また、微生物、触媒、その他の金属などの汚染源により、腐食が加速する場合もあります。フリットの錆の徴候を確認するため、すべてのカラムを、様々な保管用溶媒で 4 ヶ月間保管した後に開き、錆の有無を点検しました。室温で 4 ヶ月経過後、いずれの保管用溶媒でも錆は発生していませんでした。

ASTM G48 は、金属の耐腐食性の評価に使用される最も一般的な標準テストですが、SEC 条件で腐食をモニターするのに必要な条件とは異なる条件（強酸性の塩化鉄溶液）に左右されます。ここで使用した試験条件で錆を評価するため、以下を使用してフリットの「浸漬」実験を行いました。

1. 10% アセトニトリル/90% 25 mM Na-PO₄、pH 7.0、100 mM KCl
2. 10% アセトニトリル/90% 2.5 mM Na-PO₄、pH 7.0、10 mM KCl
3. 10% アセトニトリル/90% 0.25 mM Na-PO₄、pH 7.0、1 mM KCl
4. 10% アセトニトリル/90% Milli-Q 水

この 2 つ目の実験では、上記の各溶液 10 mL ずつを 20 mL のシンチレーションバイアルに加えました。各溶液に 4 つの 0.2 µm の 316 SS フリットを 2 回の繰り返しでセットアップしました。キャップを閉めたバイアルを 5 分間超音波処理した後、室温または 60 ℃ に放置しました。7 週間の間、バイアルを顕微鏡下で定期的にチェックしました。この期間、60 ℃ でも錆は生じませんでした。7 週間経過後、すべてのバイアルを室温で 9 ヶ月間放置しましたが、錆の生成は検出されませんでした。

3 つ目の実験では、ASTM B895 を使用しました。ASTM B895 テストは、多孔質のステンレススチールサンプルのテスト用に特別にデザインしたものです。多孔質のステンレススチール（SS）に腐食が発生するまで、5% NaCl（855 mM）への浸漬を行いました。より苛酷な試験条件にするため、フリットを 60 ℃ のオーブン中で浸漬しました。使用した SS フリット以外にも、他の多孔質の素材で試験を行いました。7 週間 5% NaCl に浸漬した後、その他の素材ではかなりの量の錆が生じていましたが、使用した SS フリットには錆は見られませんでした。

出荷時封入溶媒/保管用溶媒の共溶媒としてアセトニトリルを選択した理由の 1 つとして、10% アセトニトリルでの極限性バクテリア株の死滅によってその有効性が示されるように、細胞毒性プロファイルが挙げられます⁶。 バッファーと塩を含む保管用溶媒のみで、BioResolve SEC mAb カラムの当初の性能が維持されました。最良の効果を示した保管用溶媒は 10% アセトニトリル/90% 25 mM リン酸ナトリウム（pH 7）、100 mM KCl でした。このバッファーを更に希釈した場合でも、同様の効果が見られたので、保管用溶媒として有用なバッファーと塩の範囲があることが示唆されました。10% アセトニトリル（塩なし）のバッファーのみを含むカラムは、HMWS についての性能は維持されましたが、メインピーク/LMWS1&2 の分離度の低下が見られました。一方、10% アセトニトリル水溶液では HMWS % 面積比が 66% 減少し、ダイマーとモノマーの間の半値幅での USP 分離度は 44% 減少、LMWS1&2 % 面積比は 26% 増加し、その結果開始時の p/v 分離度が 22% 減少しました。20% MeOH/80% 水溶液でも、10% ACN/90% 水と同様の変化が見られましたが、変化の度合いは軽度でした。

カラムフリットの腐食試験により、選択した保管用溶媒が非腐食性であることが更に確認できました。この試験から、バッファーと塩の環境を使用することにより、10% アセトニトリルを静菌剤として使用することで、長期保管後にも当初のカラム性能が維持できることが示唆されています。

謝辞

著者らは、BioResolve SEC mAb カラムの開発に貢献した Steve Shiner と Justin McLaughlin、そしてこのプロジェクトを支援して助言し、エネルギーを注いでくれた Bill Warren に感謝いたします。

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