UPLC-Vion HDMS^E を用いた、複雑な果物および野菜のマトリックス中のターゲット農薬およびノンターゲット農薬のスクリーニング

高分解能質量分析（HRMS）の手法は、高分子化合物のリストを扱う（ノンターゲット取り込み）のに適しており、より多くの分子情報（フラグメント経路、同位体情報、付加イオンなど）が得られます。

食品の安全性分析に最近導入されたイオンモビリティーと HRMS の組み合わせにより、サイズ、形状、電荷に基づいたイオンの更なる分離が可能になります。Vion IMS QTof システムでは、イオンがイオン源に導入された後にイオンモビリティー分離（IMS）が行われます。その結果、化合物のコリジョン断面積（CCS、単位は Ų）値が得られ、モビリティーセル中を通過するときのイオンの平均回転値を反映するユニークなパラメーターになります。イオンモビリティーデータのユニークな点として、スペクトルのクリーンアップが挙げられます。これは、未知化合物のスペクトルを解析して、既知化合物を確認するのに役立ちます。

このアプリケーションノートでは、親イオンとフラグメントイオンの両方の精密質量データ、同位体分布、イオンモビリティー分離、質の高い UPLC分離を組み合わせて使用し、大規模なスクリーニングライブラリーを用いて、インゲン、イチゴ、ハラペーニョ、ミニパプリカの抽出物中のターゲット農薬化合物を同定する方法を実証します。また、このアプローチを利用して、野菜抽出物中に存在する新しい殺虫剤を同定しました。

アプリケーションのメリット

•  関連するレベルのターゲット農薬の同定を容易にし、スクリーニングを実施して規制対応を確保
•  化合物の追加の確認点としての CCS、および 500 種類以上の化合物を含む拡張し続けるスクリーニングライブラリーからのこれらの値の使用
•  精密質量、フルスペクトルの取り込みにより、以前はターゲットにしなかった追加の化合物を同定する機能が得られる
  

「農薬スクリーニング」という一般用語には多くの場合、複雑なサンプルと大規模なターゲットのリストが関わってきます。前者は、適用化合物の範囲を最大化するための一般化された抽出メソッドと、食品の生化学におけるバリエーションの結果です。後者は、何千もの化合物が使用登録されている結果です。タンデム四重極 MS/MS 法の使用に加え、高分解能質量分析（HRMS）手法は、高分子化合物のリストを扱う（ノンターゲット取り込み）のに適しており、より多くの分子情報（フラグメント経路、同位体情報、付加イオンなど）が得られます。食品の安全性分析に最近導入されたイオンモビリティーと HRMS の組み合わせにより、サイズ、形状、電荷に基づいたイオンの更なる分離が可能になります¹。 Waters Vion IMS QTof システムでは、イオンがイオン源に導入された後にイオンモビリティー分離（IMS）が行われます。その結果、化合物のコリジョン断面積（CCS、単位は Ų）値が得られ、イオンがモビリティーセル中を通過するときのイオンの平均回転値を反映するユニークなパラメーターになります²。イオンモビリティーデータのユニークな点として、スペクトルのクリーンアップが挙げられます³。これは、未知化合物のスペクトルを解析して、既知化合物を確認するのに役立ちます。

このアプリケーションノートでは、親イオンとフラグメントイオンの両方の精密質量データ、同位体分布、イオンモビリティー分離、質の高い UPLC 分離を組み合わせて使用し、大規模なスクリーニングライブラリーを用いて、インゲン、イチゴ、ハラペーニョ、ミニパプリカの抽出物中のターゲット農薬化合物を同定しました。データインディペンデント取得を使用して、ミニパプリカ抽出液中に、スクリーニングライブラリーに存在しない比較的新しい代替農薬を同定することができました。すべての結果をクロスチェックしたところ、正確であることがわかり、以前のタンデム四重極 MS/MS 分析で予想された化合物が同定されました。

インゲン、イチゴ、ハラペーニョ、ミニパプリカの抽出物での同定結果

非常に複雑なデータセットに対してライブラリースクリーニングアプローチを使用して、すべての抽出について、500 種類以上のターゲット化合物のリストに対して、フルスペクトルのサンプルデータを調査しました。すべてのサンプルのレビューに続いて、以前に実行した LC タンデム四重極 MS/MS 分析および同定に対してクロスチェックしたところ、予想された化合物がすべて見つかりました。これらの同定は、図 1 のミニパプリカの成分プロットに表示されています。338 ng/g ～ 10 ng/g 未満までの広い濃度範囲（「微量」レベルと記載）も、タンデム四重極 MS/MS 分析から得られたものです。

場合によっては、LC タンデム四重極 MS/MS データには報告されていませんが、ターゲット農薬の代謝物がライブラリーに存在し、同定されていたものもありました（図 1）。UNIFI ソフトウェアの［レビュー］部分内で、フィルターを使用して同定にたどり着きました。フィルターは、ユーザーが定義する柔軟な自動基準であり、解析済みデータに対して適用されます。フィルターのデータレビューへの完全な統合は、ソフトウェアの個々のワークフローのステップを通して得られます。これには、サンプルの種類（未知試料、QC、標準試料など）や前述の特定の視点での基準が含まれます。UNIFI フィルターとワークフローのさらに詳細な説明は、ウォーターズの 720005436en に記載されています。偽陽性を減らし、提案される同定に確信が持てるように、このデータセットに適用するフィルターには UNIFI スクリーニングライブラリーの情報を利用しました。具体的には、表示されているデータは、図 2 に一覧表示されている基準（つまり、質量誤差、CCS% の差（ライブラリー値から）、RT 誤差（メソッド A で得られた値から）、フラグメントイオンの存在）の範囲内でした。

付加イオンの発生は、以前より回避されていますが、ESI 実験では避けられないことがあります。したがって、CCS などのフラグメントイオンに加えて、他の基準点を使用して同定を行うことが、偽陰性を避けるのに役立つことがあります。⁺Na 付加イオンの影響で予想フラグメントイオンがなくなる場合があることを考慮するため、予想フラグメントが存在しなければならない、あるいは ⁺Na 付加イオンが観察された主なイオンであるなどの条件関数をフィルターに容易に導入することができます。図 2 ではこれを Match any of these expressions（これらの式のいずれかにマッチする）という演算子を使用して行っています。図 3 は、このフィルターがインゲンのサンプルの［レビュー］タブでどのように見えるかを示しています。フルベンジアミドでは ⁺Na 付加イオンのみが表示され、フラグメントは表示されていません。ただし、他の重要な基準（CCS、質量精度、RT）は、指定された基準に対して正確でした。フィルターを作成すると、これが分析レビューのワークフローのステップに追加され、そのステップを選択するとデータに自動的に適用されます。ただ 1 つの同定、ミニパプリカで 10 ppb 以下のレベルであったフルトリアホールでは、⁺H 付加イオンが含まれており、予想フラグメントが含まれていませんでしたが、他の基準はすべて満たされていました。

HDMS^E 法を使用して実施した農薬スクリーニング実験において、情報が豊富なデータセットが生成されました。プリカーサーイオンとフラグメントイオンの精密質量、RT、CCS などの同定基準に基づいて、データのフィルタリングやレビューを簡単に行うことができました。農薬スクリーニングに IMS を組み込むことで、CCS の測定が行えました。CCS により化合物の同定の信頼性が向上し、スクリーニング実験の追加パラメーターとして使用できます。UNIFI ソフトウェアには CCS の表示と比較計算がシームレスに組み込まれているため、レビューが簡単になります。フルスペクトル取り込みに対して処理されたこの UNIFI ライブラリースクリーニングアプローチは、取り込んだ包括的なデータを自動検索する手段を提供します。付加イオンの情報も、自動的にデータ解析に含められ、ユーザーに提示される化合物情報に組み込まれました。最後に、化学的特性に基づくインテリジェントフィルタリングを使用して、対象のノンターゲット化合物をデータセット内で検索できます。このアプローチを利用して、野菜抽出物中に存在する新しい殺虫剤を同定しました。

1.  Goscinny S, Joly L, De Pauw E, Hanot V, and Eppe G. Travelling-wave ion  mobility time-of-flght mass spectrometry as an alternative strategy for screening of multi-class pesticides in fruits and vegetables.J Chrom A.1405: 85–93, 2015.
2. Waters Food and Environment Business Team.The Use of Collision Cross  Section (CCS) Measurements in Food and Environmental Analysis.  Waters Technical Note no.720005374EN.May, 2015. 
3. Waters Food and Environment Business Team.Using Ion Mobility for Enhanced Spectral Cleanup in Food and Environmental Analysis.Waters Technical Note  no.720005375EN.May, 2015. 
4. https://www.gouvernement.fr/en/the-national-assembly-votes-in-favour-of-the-ban-on-neonicotinoid-insecticides-in-2018
5. https://www.cbc.ca/news/canada/british-columbia/health-canada-imidacloprid-neonicotinoid-1.3864450
6. Lu CS, Warchol KM, Callahan RA.In situ replication of honey bee colony  collapse disorder.Bulletin of Insectology.65: 99–106, 2012.
7. Nauen R, Jeschke P, Velten P, Beck ME, Ebbinghaus-Kintscher U, Thielert W, Wolfel K, Haas M, Kunz K, Raupach G. Flupyradifurone: a brief profile of a new butenolide insecticide.Pest Manag Sci. 71: 850–682, 2015.
8. Li Y, Liu X, Wu X, Dong F, Xu J, Zheng Y. Simultaneous determination of flupyradifurone and its two metabolites in fruits, vegetables, and grains by a modified quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe method using ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry.J Sep Sci.39(6):1090–1098, 2016.

謝辞

著者らは、サンプルをご提供いただいた米国ワシントン州 Bothell の FDA の Greg Mercer 氏および William Coole 氏に感謝致します。

実用的なソリューション

• McCullagh M, Cleland G, Hanot V, Stead S, Williams J,  Goscinny S, Rao R, and Burgess J. Collision Cross Section: A New Identification Point for a “Catch All” Non-Targeted Screening Approach.Waters Application Note no.720005055en, May, 2014.
  
• McCullagh M, Hanot V, and Goscinny S. (2014) Use of Ion Mobility Spectral Cleanup and Collision Cross Section Values to Increase Confidence and Efficiency in Pesticide Residues Screening Strategies.Waters Application Note no.720005080en.May, 2014.
  
• Mullin L, Cleland G, and McCullagh M. Demonstration of Collision Cross Section (CCS) Value Conservation across LC and GC analyses.Waters Technology Brief no.720005592en.January, 2016.