L'analisi di uno standard di idrolizzato è mostrata nella Figura 1. Gli acidi ami-no sono derivatizzati utilizzando il reagente AccQ • Fluor Ultra (numero di catalogo: 186003836) (6-amminochinolil-N-idrossisuccinimidil carbammato). Sia gli amminoacidi primari che quelli secondari reagiscono in una semplice derivatizzazione relativa al lotto e i campioni sono stabili per diversi giorni. Non è necessaria alcuna preparazione speciale dei campioni La reazione avviene in una soluzione acquosa che consente pertanto di tollerare completamente i sali tampone e gli altri componenti del campione. Il reagente in eccesso si idrolizza naturalmente e il sottoprodotto viene risolto cromatograficamente dalle derivate. Non è richiesta alcuna manipolazione o estrazione speciali.
I derivati sono separati su una colonna AccQ • Tag Ultra, 2,1 x 100 mm (p / n: 186003837), una particella etilibrida (BEH) C18 da 1,7 µm testata in modo specifico per la separazione degli amminoacidi. Gli eluenti imballati sono testati con controllo di qualità (QC) con separazioni di amminoacidi. Sono forniti come concentrati e richiedono solo la diluizione con acqua prima dell'uso. Lo strumento è il sistema ACQUITY UPLC con rivelazione UV a 260 nm.null
La risoluzione degli amminoacidi è pari o superiore a 1,6 per garantire una quantificazione accurata. La riproducibilità del tempo di ritenzione è nell'ordine dei centesimi di minuto, molto meno dell'ampiezza di un picco, per garantire una identificazione univoca degli amminoacidi. Il rivelatore è lineare, su più di tre ordini di grandezza, per consentire analisi quantitative di campioni con rapporti dispari di amminoacidi con ampio margine per campioni di concentrazione diversa. La sensibilità del metodo consente di eseguire una quantificazione segnale-rumore adeguata al livello di 50 femtomoli su colonna.
Il metodo può essere utilizzato correttamente per una vasta gamma di applicazioni. Il metodo standard illustrato nella figura 1 è in grado di risolvere anche i derivati della cisteina comunemente utilizzati nell'analisi della struttura proteica. Anche i prodotti di ossidazione dell'acido performico che fanno parte della valutazione della qualità nutrizionale degli alimenti e dei mangimi sono separati.
Per consentire il monitoraggio della composizione dei media durante la proliferazione di celle in Coltivazione, devono essere risolti ulteriori amminoacidi Ciò richiede una diluizione diversa del concentrato AccQ • Tag Ultra Eluent A e una temperatura di separazione più elevata. Il cromatogramma utilizzato per il controllo dei media di colture cellulari è illustrato nella Figura 2.
