Primer sulla Spettrometria di Massa

Nella spettrometria di massa la capacità di esercitare il controllo sugli esperimenti è di estrema importanza. Una volta creato in condizioni attentamente controllate, uno ione deve essere rivelato come evento discreto con sensibilità adeguata. Il carico di vapore minimo rendeva la GC una scelta anticipata ideale come tecnologia combinata, ma solo per il 20% circa dei composti. Oggigiorno, per introdurre gli analiti per la ionizzazione all’interno di uno spettrometro di massa, una tecnica che richiede un ambiente sottovuoto per garantire il controllo, il più delle volte si vaporizza l’eluente LC.

Un elemento importante della progettazione di qualsiasi spettrometro di massa è la capacità di pompaggio. Il vuoto deve essere ben distribuito nelle regioni atmosferiche rarefatte di uno strumento e deve essere sufficiente a compensare requisiti di progettazione quali le dimensioni dell’ingresso ionico e la quantità di vapore da rimuovere.

I requisiti di pompaggio LC-MS dipendono dall’interfaccia utilizzata. In ultima analisi, questo è stato uno dei motivi che ha spinto lo sviluppo della sorgente API in cui il vapore viene rimosso prima dell’ingresso nel sistema MS.

L’analizzatore consente di separare o differenziare gli ioni introdotti. Nella sorgente ionica si formano sia ioni positivi che ioni negativi (oltre a specie neutre non cariche). Tuttavia, viene registrata una sola polarità alla volta. Gli strumenti moderni sono in grado di invertire le polarità in millisecondi, producendo registrazioni ad alta fedeltà anche di eventi rapidi e transitori come quelli tipici della cromatografia liquida UltraPerformance (UPLC) o delle separazioni GC in cui i picchi sono larghi solo un secondo circa.

Quadrupoli

Nel 1953 i fisici della Germania occidentale Wolfgang Paul e Helmut Steinwedel descrissero lo sviluppo di uno spettrometro di massa a quadrupolo. È stato dimostrato che i potenziali di radiofrequenza (RF) e corrente continua costante (DC) tra quattro barre parallele fungono da separatore di massa, o filtro, in cui solo gli ioni all’interno di un particolare intervallo di massa, che presentano oscillazioni di ampiezza costante, potevano raccogliersi nell’analizzatore.

Gli strumenti odierni dei produttori sono destinati ad applicazioni specifiche. Gli spettrometri di massa a quadrupolo singolo richiedono una matrice pulita per evitare l’interferenza di ioni indesiderati e presentano un’ottima sensibilità.

Gli spettrometri di massa a triplo quadrupolo o tandem (MS/MS) aggiungono a uno strumento a quadrupolo singolo un quadrupolo aggiuntivo, che può agire in vari modi. Un modo consiste semplicemente nel separare e rivelare gli ioni di interesse in una miscela complessa in base al rapporto unico massa-carica (m/z) degli ioni. Un altro quadrupolo aggiuntivo si rivela utile se viene utilizzato in combinazione con esperimenti di frammentazione controllata. Tali esperimenti comportano la collisione di ioni di interesse con un’altra molecola (in genere un gas come l’argon). In tale applicazione, uno ione precursore si frammenta in ioni prodotto e lo strumento MS/MS identifica il composto di interesse in base ai suoi componenti univoci.

L’analizzatore a quadrupolo è costituito da quattro barre, generalmente disposte in parallelo e realizzate in metallo come le leghe di molibdeno. Nello sviluppo del design del quadrupolo è stato investito un’enorme quantità di arte e scienza. Le masse sono ordinate in base al movimento dei loro ioni, indotti dai campi di corrente continua (DC) e di radiofrequenza (RF) nell’analizzatore di uno strumento. La modifica sistematica dell’intensità di campo tramite il software operativo altera in effetti il valore m/z che viene filtrato o trasmesso al rivelatore in un dato momento. I quadrupoli producono una risoluzione inferiore rispetto ad alcuni spettrometri di massa come gli strumenti a tempo di volo (ToF). Tuttavia, i quadrupoli sono strumenti relativamente semplici, di facile utilizzo e di alta praticità che offrono una varietà di interfacce a un costo relativamente basso.

Per confrontare e descrivere le funzionalità della MS è necessaria una certa terminologia, definita in modo più completo più avanti in questo manuale:

Potenza di risoluzione

Spesso abbreviato in “res”, il potere di risoluzione è la capacità di uno spettrometro di massa di separare due masse:

• Res bassa = unità di massa = 1000
• Res superiore o moderata = da 1000 a 10 000
• Res elevata = 10 000+
• Res altissima = fino a 3-5 milioni
• Un esame più dettagliato della risoluzione e del modo in cui la misuriamo è riportato nella sezione “Accuratezza di Massa e Risoluzione”.

Massa esatta è il valore teorico esatto per la massa di un composto, mentre Massa accurata è il valore della massa misurata per un composto con una barra di errore associata come 5 ppm. Il valore Massa accurata viene comunemente utilizzato per fare riferimento alla tecnica anziché alla massa misurata. Criteri comunemente accettati per il lavoro sulla massa esatta (per esempio, pubblicazione su una rivista o deposito di un brevetto) sono la capacità di derivare una misura su uno strumento entro 5 ppm dalla sua massa teorica: 5 ppm a 250 Da sono 1,25 mDa (non confondere con 5 mDa, che sarebbero 20 ppm a 250 Da)

MS/MS

Descrive una serie di esperimenti: controllo delle reazioni multiple (MRM) e controllo delle reazioni singole (SRM). Ciò significa monitorare la transizione di ioni precursori, o frammentazioni, a ioni prodotto, che in genere tendono a migliorare la selettività, la specificità e/o la sensibilità della rivelazione in un esperimento strumentale a fase singola. Vengono utilizzati due analizzatori di massa in serie o due fasi dell’analisi di massa in un unico strumento.

In uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo sono presenti tre serie di filtri a quadrupolo, sebbene solo il primo e il terzo funzionino come analizzatori di massa. Progetti più recenti hanno differenziato in misura sufficiente il dispositivo centrale (sostituendo il quadrupolo dei modelli precedenti) aggiungendone una maggiore funzionalità, cosicché al suo posto viene spesso utilizzato questo termine o quadrupolo tandem. Il primo quadrupolo (Q1), fungendo da filtro di massa, trasmette e accelera uno ione selezionato verso Q2, denominato cella di collisione. Anche se in alcuni progetti Q2 è simile agli altri due quadrupoli, a questo vengono imposte RF solo per la trasmissione, non per la selezione della massa. La pressione in Q2 è più elevata e gli ioni collidono con il gas neutro nella cella di collisione. Il risultato è la frammentazione per dissociazione indotta per collisione (CID). I frammenti vengono quindi accelerati in Q3, un altro filtro di massa a scansione, che li smista prima che entrino in un rivelatore.

La dissociazione indotta per collisione (CID), nota anche come dissociazione attivata per collisione (CAD), è un meccanismo mediante il quale gli ioni molecolari vengono frammentati in fase gassosa in genere tramite accelerazione da parte del potenziale elettrico a un’alta energia cinetica nella regione del vuoto seguita dalla collisione con molecole di gas neutri come elio, azoto o argon. Una parte dell’energia cinetica viene convertita o internalizzata dalla collisione, provocando la rottura dei legami chimici e la riduzione dello ione molecolare in frammenti più piccoli. Alcuni metodi di frammentazione per scopi speciali simili includono la dissociazione per trasferimento di elettroni (ETD) e la dissociazione per cattura di elettroni (ECD). Consultare la sezione “Metodi di Ionizzazione Biomolecolare”.

Lo ione precursore 237 Da in ingresso a sinistra è stato frammentato nella cella di collisione MS/MS. Il sistema di dati è in grado di visualizzare solo i frammenti di interesse (non tutti i frammenti prodotti), in modo da ottenere uno spettro relativamente semplice rispetto allo spettro MS a scansione completa. È possibile controllare l’entità della frammentazione così come la scelta dello ione precursore.

HPLC in Fase Inversa

Il termine fase inversa descrive la modalità di cromatografia che è esattamente l’opposto della fase diretta, ovvero l’uso di una fase mobile polare e di una fase stazionaria [idrofobica] non polare. La Figura S-2 illustra la separazione della miscela di tre coloranti neri utilizzando un tale protocollo.

In alcuni settori regolamentati, per soddisfare le specifiche per l’identificazione positiva dei composti, le transizioni MRM contano per 1,5 “punti di identificazione”, mentre le tracce SIR contano per 1,0. Pertanto, supponendo una selettività sufficiente, per ottenere 3 “IPS” sono necessarie 2 transizioni MRM ma tre tracce SIR.

Il settore magnetico, o un analizzatore di massa a campo settoriale, è uno dei primi progetti di strumenti che persiste ancora oggi, sebbene in misura minima (essendo stato sostituito dai moderni strumenti ESI che possono funzionare in modalità di ionizzazione ESI). Il software Waters AutoSpec, per esempio, è utilizzato universalmente per l’analisi delle diossine a sensibilità estremamente elevata.

I settori piegano le traiettorie ioniche a forma di arco. I rapporti “momento-carica” degli ioni determinano il raggio delle traiettorie, che a loro volta sono determinate da un campo elettrico e/o magnetico. Gli ioni con rapporti m/z maggiori seguono percorsi più lunghi rispetto a quelli con rapporti più piccoli. I percorsi sono controllati variando l’intensità del campo magnetico. Gli spettrometri di massa a doppia focalizzazione combinano campi magnetici ed elettrici in varie combinazioni, sebbene il settore elettrico seguito da quello magnetico sia più comune. Questa primitiva ibridazione utilizza il settore elettrico per focalizzare gli ioni in base alla loro energia cinetica quando escono dalla sorgente. La focalizzazione angolare preceduta da quella energetica produce separazioni di ioni con la stessa massa nominale ma con formule chimiche diverse.

Il funzionamento di uno strumento di intercettazione ionica è simile a quello di uno strumento a quadrupolo. A differenza dello strumento a quadrupolo, che filtra gli ioni in flusso, sia il dispositivo di intercettazione ionica che lo strumento a risonanza ciclotronica (ICR) immagazzinano gli ioni in uno spazio tridimensionale. Prima che si verifichi la saturazione, il dispositivo di intercettazione o il ciclotrone consentono l’espulsione degli ioni selezionati, in base alle loro masse, per la rivelazione. È possibile eseguire una serie di esperimenti entro i confini del dispositivo di intercettazione, frammentando uno ione di interesse per definire meglio il precursore in base ai suoi frammenti. I campi generati dalle tensioni RF applicate a una geometria sovrapposta o a “sandwich” (elettrodi di chiusura alle estremità opposte) intrappolano gli ioni nello spazio tra i due elettrodi. La rampa o la scansione della tensione RF consentono di espellere gli ioni dalla loro frequenza secolare, o condizione di intrappolamento. L’intervallo dinamico a volte è limitato. Il volume finito e la capacità degli ioni limitano l’intervallo dello strumento, in particolare per i campioni in matrici complesse.

Gli strumenti a intercettazione ionica sono stati introdotti negli anni ’80. Ma le limitazioni imposte dallo schema di ionizzazione interno utilizzato in questi primi strumenti ne impedivano l’uso per molte applicazioni. Solo con l’avvento della ionizzazione esterna gli strumenti sono diventati più universalmente pratici.

La capacità di eseguire la frammentazione sequenziale e di derivare quindi più informazioni strutturali da un singolo analita (ovvero frammentando uno ione, selezionando un particolare frammento e ripetendo il processo) è definita MSn. I picchi cromatografici del sistema GC non sono abbastanza larghi da consentire più di una singola frammentazione (MS/MS o MS2). Gli strumenti a intercettazione ionica eseguono esperimenti MS/MS o esperimenti di frammentazione nel tempo anziché nello spazio, come gli strumenti a quadrupolo e a settore. Pertanto, non possono essere utilizzati in determinati esperimenti MS/MS come la perdita neutra e il confronto degli ioni precursori. Inoltre, nel funzionamento MS/MS con uno strumento di intercettazione ionica, il terzo inferiore dello spettro MS/MS va perso, una conseguenza della progettazione del dispositivo di intercettazione. Per far fronte a tale perdita, alcuni produttori rendono disponibili tramite i rispettivi software requisiti di scansione più ampi che richiedono la commutazione dei parametri operativi durante l’acquisizione dei dati.

Il design del dispositivo di intercettazione pone un limite superiore al rapporto tra il rapporto massa-carica (m/z) di un precursore e il frammento ionico intrappolato più basso, comunemente noto come “regola del terzo”. Per esempio, i frammenti di ioni di uno ione a m/z 1500 non verranno rivelati al di sotto di m/z 500, una limitazione significativa per il sequenziamento de novo di peptidi. Il dispositivo di intercettazione ionica ha un intervallo dinamico limitato, conseguenza degli effetti di carica spaziale quando troppi ioni entrano nello spazio di intercettazione. I produttori hanno sviluppato la scansione automatica, che conta gli ioni prima che entrino nel dispositivo di intercettazione, limitando il numero consentito di ingressi. Possono comunque verificarsi problemi quando è presente una quantità relativamente piccola di uno ione di interesse in una vasta popolazione di ioni di fondo.

A causa delle somiglianze nella progettazione funzionale, gli strumenti a quadrupolo sono ibridati per incorporare i vantaggi del quadrupolo in flusso e del comportamento di intercettazione ionica per migliorare la sensibilità e consentire esperimenti al volo non possibili con nessuno dei due. Tali strumenti sono talvolta chiamati intercettazioni lineari o Q-trap. L’aumento del volume di uno strumento di intercettazione lineare (su un dispositivo di intercettazione ionica tridimensionale) migliora l’intervallo dinamico.

Gli strumenti di intercettazione ionica non eseguono la scansione come uno strumento a quadrupolo, perciò l’uso della tecnica di monitoraggio a ione singolo (SIM) o di controllo ionico selettivo (SIR) non migliora la sensibilità sui dispositivi di intercettazione ionica come sugli strumenti a quadrupolo e a settore.

I ciclotroni ionici a trasformata rapida di Fourier (FTICR) rappresentano l’estrema capacità di misurare la massa con la capacità di risolvere masse strettamente correlate. Anche se poco pratico per la maggior parte delle applicazioni, un magnete da 14,5 tesla può raggiungere una risoluzione superiore a 3,5 milioni e quindi mostrare la differenza tra entità molecolari le cui masse variano di meno della massa di un singolo elettrone.

Gli strumenti del ciclotrone intrappolano gli ioni in modo elettrostatico in una cella utilizzando un campo magnetico costante. Gli impulsi di tensione RF creano un movimento ionico orbitale e gli ioni in orbita generano un piccolo segnale in corrispondenza delle piastre di rivelazione della cella (frequenza orbitale ionica). La frequenza è inversamente proporzionale al valore m/z degli ioni e l’intensità del segnale è proporzionale al numero di ioni m/z presenti nella cella. A pressioni di cella molto basse, un ciclotrone è in grado di mantenere l’orbita ionica per periodi prolungati, fornendo misure ad altissima risoluzione.

La tecnica della dissociazione indotta per collisione fuori-risonanza continuata (SORI-CID) è una tecnica CID utilizzata nella spettrometria di massa a risonanza ciclotronica a trasformata di Fourier. Gli ioni subiscono un’accelerazione nel movimento del ciclotrone in cui l’aumento della pressione provoca collisioni che producono frammenti. Dopo la frammentazione, la pressione viene ridotta e il vuoto spinto viene ripristinato per analizzare gli ioni frammento.

Gli strumenti a tempo di volo (ToF), sebbene sviluppati molti anni fa, sono diventati la base di molti lavori moderni grazie alla loro elettronica rapida e precisa e alle moderne tecniche di ionizzazione come ESI. Uno strumento ToF fornisce una misurazione di massa accurata con una precisione di poche parti per milione (ppm) rispetto alla massa reale di una molecola. Lo strumento ToF è un analizzatore di massa a dispersione temporale che viene utilizzato in modo lineare o, con l’ausilio di griglie e lenti elettrostatiche, come specchio ionico. Quando viene utilizzato come specchio ionico, la risoluzione viene aumentata senza che si perda drasticamente la sensibilità o che sia necessario aumentare le dimensioni del tubo di volo (o deriva).

Le analisi ToF comportano l’accelerazione di un gruppo di ioni, in un breve burst, verso un rivelatore. Gli ioni escono dalla sorgente, avendo ricevuto ciascuno da un elettrodo “spingitore” una carica elettrica identica, o potenziale. Il potenziale di ogni ione accelera, ovvero lo lancia, in un tubo a pressione molto bassa. Poiché tutti gli ioni con carica simile condividono la stessa energia cinetica (energia cinetica = ½ mv² dove m è la massa ionica e v la velocità), gli ioni con massa inferiore mostrano una velocità maggiore e un intervallo minore prima di colpire il rivelatore. Poiché massa, carica ed energia cinetica determinano il tempo di arrivo di uno ione al rivelatore, la velocità dello ione può essere rappresentata come v = d/t = (2Ke/m)^1/2. Gli ioni percorrono una determinata distanza (d) in tempo (t), dove t dipende dal rapporto massa-carica (m/z). Poiché tutte le masse sono misurate per ciascuna “spinta”, lo strumento ToF può raggiungere una sensibilità molto elevata rispetto agli strumenti a scansione.

Oggi i sistemi MS a quadrupolo eseguono scansioni in routine a 10 000 Da, o amu, al secondo. Pertanto, una scansione completa, anche di breve durata, per esempio un picco LC o GC di 1 secondo, catturerebbe ogni ione 10 o più volte in ogni secondo. Il rivelatore dello strumento ToF registra il bombardamento degli ioni sulla piastra in nanosecondi l’uno dall’altro. Tale risoluzione offre le funzionalità aggiuntive di un ampio intervallo dinamico e una maggiore sensibilità rispetto a uno strumento di scansione come un quadrupolo. Tuttavia, lo strumento a quadrupolo è, in genere, più sensibile nella rivelazione di analiti target in miscele complesse e, pertanto, è in genere uno strumento di quantificazione migliore. Alcuni strumenti, come i dispositivi di intercettazione ionica, offrono una combinazione di queste funzionalità. Ma fino all’avvento degli strumenti ibridi, nessuno era in grado di offrire prestazioni di alto livello sotto tutti gli aspetti.

I primi modelli MALDI-ToF (che utilizzavano la ionizzazione per desorbimento laser assistita da matrice) acceleravano immediatamente l’uscita degli ioni dalla sorgente di ionizzazione. La loro risoluzione era relativamente scarsa e la loro accuratezza limitata. L’estrazione ritardata (DE), sviluppata per gli strumenti MALDI-ToF, “raffredda” e focalizza gli ioni per circa 150 nanosecondi dopo la loro formazione. Quindi accelera gli ioni nel tubo di volo. Gli ioni raffreddati hanno una distribuzione dell’energia cinetica inferiore rispetto a quelli non raffreddati e, in ultima analisi, riducono la diffusione temporale degli ioni quando entrano nell’analizzatore ToF, con conseguente aumento della risoluzione e dell’accuratezza. DE è significativamente meno vantaggiosa con macromolecole (per esempio proteine > 30 000 Da).

Ibridi

Il termine “ibrido” si applica a vari modelli di spettrometri di massa che sono composti da tecnologie esistenti come la doppia focalizzazione, i settori magnetici e, più recentemente, i dispositivi di intercettazione ionica che “fronteggiano” i ciclotroni. Uno dei progetti più interessanti, lo spettrometro di massa a quadrupolo a tempo di volo (QToF), accoppia uno strumento ToF con uno strumento a quadrupolo. Questo abbinamento consente di ottenere la migliore combinazione di diverse caratteristiche delle prestazioni: misurazione di massa accurata, possibilità di eseguire esperimenti di frammentazione e quantificazione di alta qualità.

Un’ulteriore evoluzione ha prodotto l’accoppiamento di separazioni e misure di mobilità ionica con la spettrometria di massa tandem. La spettrometria di massa con mobilità ionica (nota: qui utilizzo l’acronimo “IMMS” poiché la spettrometria di massa per immagini è spesso abbreviata in “IMS”) è una tecnica che differenzia gli ioni in base a una combinazione di fattori: dimensioni, forma e carica, nonché loro massa. I dispositivi IMMS sono comunemente utilizzati negli aeroporti e nelle unità da campo portatili per la rivelazione rapida (20 msec) di piccole molecole di cui si conosce la mobilità, per esempio alcuni narcotici ed esplosivi. Quando viene adattato agli strumenti di ordine superiore, il sistema IMMS fornisce una dimensione di separazione ortogonale (sia per LC che per MS) e alcune funzionalità uniche che rendono possibili, tra le diverse opzioni:

• Separazione di isomeri, isobare e conformeri (dalle proteine alle piccole molecole) e determinazione della loro sezione di collisione rotazionale media
• Migliore separazione di miscele complesse (mediante MS o LC-MS) con conseguente aumento della capacità dei picchi e della pulizia del campione (separazione fisica di ioni, in particolare rumore chimico, e ioni che interferiscono con gli analiti di interesse)
• Prestazioni di CID/IMMS, IMMS/CID o CID/IMMS/CID e aumento della quantità di informazioni significative ottenibili dagli esperimenti di frammentazione negli studi di determinazione strutturale

In tutti e tre gli scenari analitici, la combinazione di mobilità ionica ad alta efficienza e spettrometria di massa tandem può aiutare a superare problemi analitici che non potrebbero essere affrontati con altri mezzi analitici, inclusa la spettrometria di massa convenzionale o la strumentazione per cromatografia liquida.

L’articolo compilativo di H.H. Hill Jr., et al., citato alla fine di questa sezione, mette a confronto vari tipi di spettrometri di massa a mobilità ionica disponibili alla pubblicazione dell’articolo del 2007 e descrive i vantaggi della loro applicazione ad un ampio gamma di analiti Si rivolge a quattro metodi di separazione con mobilità ionica attualmente utilizzati con la spettrometria di massa:

• Spettrometria di mobilità ionica in tempo di deriva (DTIMS)
• Spettrometria di mobilità ionica in aspirazione (AIMS)
• Spettrometria a mobilità differenziale (DMS), detta anche spettrometria di mobilità ionica a forma d’onda asimmetrica di campo (FAIMS)
• Spettrometria a mobilità ionica a onda progressiva (TWIMS)

Secondo gli autori “la DTIMS fornisce il più alto potere di risoluzione IMS ed è l’unico metodo (IMMS) in grado di misurare direttamente le sezioni d’urto di collisione. L’AIMS è un metodo di separazione con mobilità a bassa risoluzione, ma può monitorare gli ioni ininterrottamente. DMS e FAIMS offrono funzionalità di monitoraggio ionico continuo, nonché separazioni a mobilità ionica ortogonale in cui è possibile ottenere un’elevata selettività di separazione. TWIMS è un nuovo metodo (IMMS) il cui potere di risoluzione è relativamente basso. Tuttavia, dimostra una buona sensibilità ed è ben integrato nel funzionamento di uno spettrometro di massa commerciale.”

Unitamente alla MS, la mobilità ionica viene applicata anche per studiare le strutture in fase gassosa delle biomolecole. Pringle et al.(citato in questa sede) esaminano la separazione di mobilità di alcuni ioni peptidici e proteici utilizzando un quadrupolo ibrido/separatore di mobilità ionica a onda progressiva/strumento a tempo di volo ad accelerazione ortogonale. Il confronto dei dati di mobilità ottenuti dal dispositivo di separazione di mobilità ionica a onda progressiva (TWIMS) con quelli ottenuti utilizzando vari altri separatori di mobilità indica che “sebbene le caratteristiche di mobilità siano simili, la nuova geometria ibrida dello strumento fornisce la separazione per mobilità senza compromettere la sensibilità di base dello spettrometro di massa. Questa funzionalità facilita gli studi sulla mobilità dei campioni a livelli analiticamente significativi.”

Vedere anche:

• Special Feature Perspective: Ion mobility-Mass Spectrometry, A. B. Kanu, P. Dwivedi, M. Tam, L. Matz and H. H. Hill Jr., J. Mass Spectrom. 2008; 43: 1-22 pubblicato online in Wiley InterScience, (https://onlinelibrary.wiley.com/) DOI: 10.1002/jms.1383
  • Perché è importante: una panoramica concisa della mobilità ionica associata alla MS. Sono forniti centosessanta riferimenti sulla spettrometria di massa con mobilità ionica (IMMS).
    
• Uno studio della separazione di mobilità di alcuni ioni peptidici e proteici tramite un nuovo strumento ibrido quadrupolo/IMS  a onda progressiva/oa-ToF, S. D. Pringle, K. Giles, J. L. Wildgoose, J. P. Williams, S. E. Slade, K. Thalassinos, R. H. Bateman, M. T. Bowers, J. H. Scrivens, pubblicato online (www.sciencedirect.com), International Journal of Mass Spectrometry (2006), doi:10.1016/j.ijms.2006.07.021
  • Perché è importante: descrive il funzionamento del sistema IMMS con le biomolecole.