Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

L’iniezione del campione può essere eseguita manualmente per una bassa produttività oppure può essere automatizzata per applicazioni ad alta produttività. Nell’iniezione manuale, una valvola Rheodyne dotata di loop di iniezione viene rimossa dal circuito idraulico ruotando la relativa manopola. Un campione filtrato viene aspirato in una siringa dotata di ago a punta smussata per rimuovere le bolle d’aria. L’ago viene inserito nella porta di iniezione per erogare il campione nel loop di iniezione. La manopola della valvola Rheodyne viene ruotata per reinserire il loop di iniezione nel circuito idraulico. In questa posizione il campione viene inserito nel circuito idraulico.

L’iniezione del campione può anche essere automatizzata per ottenere una produttività elevata. I campionatori automatici ad alta capacità sono in grado di gestire l’aspirazione e l’iniezione dei campioni su un’unica piattaforma. Nel software di purificazione è configurato un braccio robotico per controllare l’iniezione di campioni da piastre per microtitolazione, tubi per test, vial di scintillazione o vial per campionatori automatici convenzionali.

Loop di iniezione

In genere, un loop di iniezione viene selezionato in base alle dimensioni del volume di iniezione previsto. Quando il volume del loop è eccessivo, il campione potrebbe assorbire fino alla superficie in eccesso del loop causando un ritardo, oppure può verificarsi la dispersione del campione: entrambe le situazioni possono incidere negativamente sulla qualità della cromatografia. Un loop di dimensioni prossime al volume di iniezione previsto garantisce la migliore riproducibilità e il miglior profilo cromatografico.

Raccoglitori di Frazioni

La produttività desiderata per l’applicazione determina il livello di automazione necessario per la raccolta delle frazioni. Un raccoglitore di frazioni è costituito da un interruttore e da una valvola di deviazione del campione. La valvola di deviazione si apre al momento opportuno per consentire la raccolta dei composti durante l’eluizione.

La raccolta delle frazioni può essere eseguita manualmente per le applicazioni a bassa produttività, ma può anche essere automatizzata per ottenere una produttività maggiore. Il livello di automazione è determinato dal numero e dal volume di frazioni desiderate. I raccoglitori di frazioni ad alta produttività spesso combinano l’iniezione del campione e la raccolta delle frazioni sullo stesso piano di lavoro utilizzando un braccio robotico dotato di sonde di campionamento e raccolta delle frazioni.

Recipienti di Raccolta

Molti sistemi di purificazione sono in grado di contenere recipienti di raccolta di forme, dimensioni e volumi diversi. I recipienti di raccolta più comuni includono tubi per test, vial, flaconi o imbuti per l’erogazione in recipienti di grandi dimensioni. Al momento dell’esposizione al campione e al solvente, i recipienti di raccolta devono essere puliti, asciutti e inerti. In genere si trovano nel letto di raccolta del recipiente senza chiusura superiore per consentire l’erogazione dell’isolato.

Con alcuni sistemi di raccolta, le frazioni che non vengono raccolte non vengono smaltite, ma possono essere inviate in un contenitore di scarico specifico per il campione. Se l’utilizzatore raccoglie il picco errato, esegue un metodo inadeguato, non riesce a rivelare il target o non riesce ad avviare la raccolta, il flusso si dirige in uno specifico contenitore di scarico dal quale è possibile far evaporare il solvente, ridissolvere e reiniettare il campione.

Rivelatori

Quando si esegue la cromatografia di purificazione, è necessario prestare particolare attenzione alla rivelazione. I quattro principali tipi di rivelatori utilizzati per la purificazione sono UV/Visibile, indice di rifrazione (RI), evaporative light scattering (ELS) e spettrometria di massa (MS).

I rivelatori possono rivelare a una singola lunghezza d’onda che può essere impostata dall’utilizzatore (UV/Visibile) oppure l’assorbanza su un intervallo di lunghezze d’onda può essere raccolta da un rivelatore a serie di fotodiodi (PDA). Il PDA viene spesso utilizzato durante lo sviluppo del metodo per selezionare una lunghezza d’onda adeguata per il composto di interesse. Per farlo, si raccolgono lunghezze d’onda comprese tra 200 e 400 nm o superiori (≥350 nm) quando si opera nel campo di visibilità. La lunghezza d’onda che fornisce l’intensità massima del segnale per il composto di interesse è la lunghezza d’onda ottimale per l’isolamento. È inoltre necessario determinare la lunghezza d’onda ottimale per le impurezze a eluizione ravvicinata. In caso contrario, un “isolato puro” raccolto a una lunghezza d’onda in realtà può contenere impurezze se osservato a una lunghezza d’onda diversa. In tal caso, potrebbe essere necessario lo sviluppo e la purificazione di un metodo secondario per purificare ulteriormente l’isolato.

Quando si utilizzano rivelatori UV/Visibile e PDA, una sensibilità elevata può rappresentare un ostacolo a causa dei volumi di iniezione elevati e delle alte concentrazioni di campione, comuni durante la purificazione. Di conseguenza, si utilizzano celle di flusso del rivelatore con percorso corto (1-3 mm) anziché celle di flusso analitiche con percorso lungo (10 mm).

I rivelatori RI presentano dei vantaggi per la rivelazione di componenti con assorbimento UV limitato o nullo, come alcoli, zuccheri, saccaridi, acidi grassi e polimeri. Il rivelatore RI rivela le differenze nell’indice di rifrazione per determinare la presenza o l’assenza di un composto. Il rivelatore RI è talvolta definito rivelatore “universale” perché non dipende dal composto ionizzante o contenente un cromoforo. Uno svantaggio del rivelatore RI è che può essere utilizzato solo in separazioni isocratiche al fine di evitare la rivelazione di disturbi del gradiente che causano la deriva della linea di base.

I rivelatori ELS possono essere utilizzati in alternativa ai rivelatori UV/Visibile e RI. I rivelatori ELS fanno passare l’eluito attraverso un nebulizzatore riscaldato per volatilizzare l’analita e far evaporare il solvente. Il solvente viene trasportato come gas, ma l’analita forma un flusso di particelle fini che passa tra una sorgente luminosa e un rivelatore che diffonde la luce e ne misura l’effetto. I principali vantaggi dei rivelatori ELS sono la rivelazione di composti privi di cromoforo e la possibilità di essere utilizzati sia in separazioni isocratiche che in gradiente. Uno svantaggio è che i rivelatori ELS sono distruttivi per il campione, quindi il rivelatore non può essere messo in linea con il circuito idraulico principale. Il circuito idraulico deve essere suddiviso in modo che una piccola parte vada al rivelatore ELS e il resto al raccoglitore di frazioni.

I rivelatori MS identificano i composti separati del campione che emergono dalla colonna in base alla loro massa e allo spettrometro di massa. L’MS è uno dei metodi di analisi molecolare più sensibili e altamente selettivi e fornisce informazioni sul peso molecolare, nonché sul modello delle frammentazioni della molecola dell’analita, inestimabili per confermare l’identità dell’analita. Sono disponibili vari tipi di sistemi MS che incorporano diversi tipi di interfacce. Le interfacce più comuni sono l’elettronebulizzazione (ESI) e la ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI). A ciascuna interfaccia sono associati diversi campi di applicabilità, capacità di velocità di flusso, sensibilità e linearità della risposta. Analogamente ai rivelatori ELS, l’MS è una tecnica distruttiva, pertanto il flusso deve essere suddiviso in modo che una piccola parte entri nel rivelatore e la parte principale vada al raccoglitore di frazioni.

Divisori di Flusso

Per i rivelatori chimicamente distruttivi come quelli dei sistemi MS o ELS, una parte del flusso proveniente dalla colonna deve essere separata dal flusso principale per raggiungere il rivelatore e attivare le frazioni. Poiché i rivelatori devono rivelare un picco prima di attivare il raccoglitore di frazioni (tempo di ritardo), il flusso separato deve arrivare al rivelatore prima che il flusso principale raggiunga il raccoglitore di frazioni. A tale scopo, la velocità del flusso separato viene incrementata utilizzando una “pompa di reintegro” e un “solvente di reintegro”.

I divisori di flusso possono essere “passivi” o “attivi”. I divisori di flusso passivi e attivi sono ugualmente efficaci nel campionamento del flusso del campione principale, quindi il tipo di divisore utilizzato dipende dalle preferenze dell’utilizzatore.

I divisori passivi comportano l’uso di un tubo restrittivo come una bobina di ritardo e “raccordi a T” per mantenere un intervallo di velocità di flusso e un rapporto di frazionamento specifici.

Un divisore di flusso attivo presenta due circuiti idraulici completamente separati e una valvola a commutazione rapida che trasferisce una parte del flusso principale nel flusso di reintegro, dove viene diluito in base a un rapporto di frazionamento programmato.

Tubo

Per decidere il tubo da utilizzare per il circuito idraulico, è necessario fare alcune considerazioni. In primo luogo, la garanzia dell’integrità del tubo del circuito idraulico del sistema dipende in larga misura dall’adeguatezza del materiale di cui è composto il tubo e dall’applicazione. Il tubo può essere realizzato in polimero ingegnerizzato ad alte prestazioni PEEK (polietereterchetone) o acciaio inox e deve essere chimicamente compatibile con il campione e la fase mobile per evitare che il campione si attacchi alla superficie del tubo, causando perdita di campione, bassa resa o carryover.

Il tubo del sistema deve anche essere in grado di resistere alle pressioni e alle temperature di funzionamento del circuito idraulico, sebbene con la cromatografia di purificazione il controllo della temperatura del circuito idraulico spesso non venga utilizzato e, pertanto, non costituisca un problema significativo.

Quando si considerano i limiti di pressione, i sistemi di purificazione cromatografica possono essere separati in tre zone: la zona a “bassa pressione” tra il recipiente del solvente e la pompa, la zona ad “alta pressione” tra la pompa e l’ingresso della colonna e una seconda zona a “bassa pressione” tra l’uscita della colonna e il recipiente di scarico o il raccoglitore di frazioni dopo il rivelatore. Il tubo presente in ciascuna zona ha requisiti di mantenimento della pressione unici. La selezione di un materiale non adeguato per il tubo in una zona di pressione con requisiti critici può portare non solo a prestazioni scarse e a problemi cromatografici, ma anche a perdite e rotture.

È necessario prendere in considerazione due variabili: il diametro interno e la lunghezza del tubo. In genere, minore è il diametro interno, maggiore è la velocità interna e minore è la dispersione del campione, in modo che il campione rimanga il più concentrato possibile. Tuttavia, man mano che il diametro del tubo interno diminuisce, la pressione creata dal tubo può incrementare in modo significativo, provocando una potenziale contro-pressione del sistema incompatibile con la cella di flusso del rivelatore o con altri componenti del sistema. Quando si collegano tratti di tubo di diametro interno diverso, si può formare volume morto in corrispondenza o in prossimità della giunzione. Questo volume morto può causare problemi di forma del picco e carryover in quanto i volumi non vengono puliti adeguatamente dal fluido o dalla fase mobile.

Quando si considera la lunghezza del tubo, maggiore è il volume del circuito idraulico prodotto, maggiori sono le probabilità che il campione si diluisca nella fase mobile e che i componenti separati vadano a riunirsi. La lunghezza del tubo può contribuire anche alle pressioni del sistema, ai volumi di ritardo e ai volumi aggiuntivi della colonna. Per evitare questi problemi, la lunghezza del tubo.

I sistemi di purificazione per la preparazione su larga scala in genere funzionano a velocità di flusso elevate. Per moderare la contro-pressione causata da queste velocità di flusso, è importante che nel sistema di purificazione venga collegato un tubo di diametro adeguato in modo da garantire risultati cromatografici di alta qualità. È disponibile una gamma di diametri di tubo per velocità di flusso comprese tra 0,05 mL/min e 130 mL/min.