Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

Quando vi è una dimostrazione iniziale del valore potenziale di un isolato, è possibile effettuare lo “scale-up” di un metodo di separazione per generare maggiori quantità di tale isolato per un’ulteriore valutazione. Attributi di separazione su piccola scala, come la risoluzione, possono essere mantenuti facilmente su larga scala. La velocità di flusso, il carico del campione e i componenti hardware del sistema devono essere modificati per trasferire la separazione a colonne a capacità più elevata in maniera efficace mediante formule matematiche definite.

La prima fase di scale-up di solito comprende la produzione di quantità da mg a grammi di isolato per vari usi che vanno dalla valutazione biologica precoce alla determinazione di relazioni struttura-attività per analoghi di prodotti con proprietà terapeutiche migliorate. Ulteriori fasi di scale-up coinvolgono quantità di materiale da 100 g a più chilogrammi e oltre per lo sviluppo preclinico e clinico, che in caso di successo culminerà nella produzione su vasta scala. Su questa scala entrano in gioco la documentazione e i controlli qualità come le buone prassi di fabbricazione (cGMP).

Il workflow di scale-up è un processo graduale. I calcoli di scale-up devono essere eseguiti accuratamente, altrimenti il risultato finale potrebbe non fornire la risoluzione ottenuta nella separazione su piccola scala. Per incrementare la riuscita della scalabilità del metodo e mantenere il tempo di ritenzione e la selettività, è necessario considerare attentamente diversi requisiti:

• La fase mobile utilizzata su piccola e larga scala deve essere la stessa.
• Colonne con caratteristiche chimiche, lunghezza e dimensioni delle particelle identiche semplificano lo scale-up (in alternativa, le dimensioni delle particelle possono essere modificate purché si mantenga il rapporto tra la lunghezza della colonna e le dimensioni delle particelle L/dp del metodo iniziale).
• I campioni devono essere preparati alla stessa concentrazione e nello stesso diluente.

Determinazione del Volume di Sosta

Il volume di sosta (volume di ritardo, volume del sistema) è importante per conservare la risoluzione dei picchi a eluizione anticipata quando si esegue lo scale-up o si cambia sistema. È definito come il volume tra il punto di formazione del gradiente e la testa della colonna. Per i sistemi LC con miscelazione ad alta pressione questo volume è costituito principalmente dal miscelatore, dal tubo di collegamento e dal loop del campionatore automatico. I sistemi di miscelazione a bassa pressione combinano i solventi a monte della pompa, in modo che un altro tubo più il volume di una o più teste della pompa più il miscelatore, il tubo di collegamento e il loop del campionatore automatico contribuiscano al volume di sosta complessivo.

Quando i componenti della fase mobile vengono miscelati in linea per le separazioni isocratiche, il volume di sosta è ancora presente, ma poiché la concentrazione della fase mobile è costante, non vi sono differenze osservabili nella cromatografia. I metodi a gradiente, d’altro canto, si basano su una variazione nel tempo della concentrazione della fase mobile per generare la separazione dei picchi. La compensazione del volume di sosta in un metodo a gradiente garantisce il mantenimento dei tempi di ritenzione dei picchi, aspetto particolarmente importante quando si tratta di raccogliere frazioni purificate.

Per determinare il volume di sosta, è possibile utilizzare un gradiente a gradini dei solventi della fase mobile A e della fase mobile B contenenti un additivo con assorbimento UV diverso (per esempio 0,05 mg/mL di uracile o 0,2% di acetone in acetonitrile) secondo il metodo disponibile in “Analytical to Prep Gradient Calculator” alla pagina www.waters.com/prepcalculator.

Capacità

Nella cromatografia di purificazione l’obiettivo primario è il mantenimento di una risoluzione adeguata per il composto destinato alla raccolta. La capacità della colonna, o carico, è misurata mediante la risoluzione del composto e dei picchi adiacenti. Sebbene la capacità della colonna sia influenzata principalmente dalla lunghezza e dal diametro della colonna, altri fattori possono contribuire, quali la solubilità e la complessità della miscela di campioni. La capacità ha il seguente andamento:

• La capacità dipende principalmente dalla solubilità del campione specifico.
• La capacità è maggiore per le miscele semplici.
• La capacità è inferiore laddove è richiesta una risoluzione elevata.
• La capacità dipende dalle condizioni di caricamento.

La capacità per uno specifico composto di interesse viene determinata prima dello scale-up del metodo tramite studi di caricamento. Questi studi vengono eseguiti su piccola scala con una delle seguenti tecniche: un campione viene preparato a una concentrazione elevata e il volume di iniezione viene incrementato in modo incrementale oppure un campione viene preparato a più concentrazioni e il volume di iniezione viene mantenuto costante. Per entrambe le tecniche, l’obiettivo è determinare la concentrazione massima o il volume di iniezione in grado di mantenere una risoluzione adeguata del composto di interesse dalle impurezze circostanti. Una volta determinata la capacità della colonna, è possibile effettuare lo scale-up utilizzando una formula per workflow e colonne di diametro maggiore.

Equazione 10: scale-up del carico di concentrazione

Pertanto, per eseguire lo scale-up di un carico di 1800 µg (1,8 mg) su una colonna analitica di 4,6 mm x 50 mm al carico equivalente su una colonna preparativa da 19 mm x 50 mm:

Equazione 11: scale-up del volume di iniezione

Per eseguire lo scale-up del volume di iniezione di 20 µL:

Diluizione in colonna

Solventi forti come il DMSO possono migliorare la solubilità dei campioni con conseguente potenziale incremento della capacità della colonna. Sfortunatamente, volumi di iniezione elevati di solventi forti possono alterare la cromatografia con conseguente riduzione, anziché incremento, della quantità di prodotto che può essere isolata correttamente.

L’alterazione avviene quando il solvente forte viene trasportato dall’iniettore alla testa della colonna sotto forma di tappo inserito in un flusso di solvente acquoso. La precipitazione del campione può verificarsi in corrispondenza dei bordi del tappo nel punto in cui il solvente forte del campione viene diluito con il solvente acquoso. Questa precipitazione può provocare l’ostruzione del circuito idraulico e lo spegnimento del sistema ad alta pressione.

Se la precipitazione non provoca lo spegnimento del sistema, il campione entra nella colonna, ma vi sarà una ritenzione soltanto quando il tappo di campione viene diluito con la fase mobile. Nel caso di iniezioni di dimensioni maggiori, il volume necessario per diluire il campione può essere ottenuto solo spostando il tappo di una notevole distanza lungo la colonna. In tali casi, il campione si deposita come un’ampia banda che occupa una grande frazione del volume della colonna. Il risultato è una risoluzione incompleta dei picchi distribuiti su grandi volumi di eluente. Questa situazione potrebbe essere ridotta limitando rigorosamente sia il volume che la massa del campione iniettato.

L’alternativa è una diluizione sostanziale del campione con acqua o con un solvente debole per garantire una ritenzione adeguata.

Nessuno dei due approcci è del tutto soddisfacente in quanto vengono compromessi la produttività e il recupero. In alternativa, in un sistema di diluizione in colonna, il sistema viene riconfigurato in modo da trasportare il tappo di campione all’ingresso della colonna, dove viene diluito continuamente con un flusso di diluente acquoso. La velocità di trasferimento nella colonna è così elevata da impedire la precipitazione. Le molecole del campione vengono quindi adsorbite sul materiale di impaccamento sotto forma di bande molto strette che possono essere eluite sotto forma di picchi ben risolti di piccolo volume. La robustezza del sistema migliora con la diluizione in colonna poiché il campione ha una capacità limitata di precipitare nel loop o in corrispondenza della testa della colonna.

La migliore risoluzione tra i picchi dei componenti del campione consente di incrementare le dimensioni del campione e quindi di ridurre il numero di iniezioni necessarie per l’isolamento. In pratica, con la diluizione in colonna, spesso il caricamento della colonna può essere incrementato da tre a cinque volte. Si riduce l’incidenza degli arresti ad alta pressione, prolungando la durata utile delle colonne.

Scale-Up della Velocità di Flusso

Per mantenere correttamente la qualità della separazione durante lo scale-up, la velocità lineare deve rimanere costante tra colonne su piccola e larga scala; pertanto, la scala della velocità di flusso funziona meglio tra colonne su larga e piccola scala aventi la stessa lunghezza, dimensione delle particelle e materiale di impaccamento. Per la scalabilità della velocità di flusso, è necessario tenere in considerazione le funzionalità dei componenti hardware del sistema, quali il flusso massimo della pompa e i limiti di contro-pressione. Se i componenti hardware non soddisfano i requisiti di velocità di flusso, è necessario prendere in considerazione opportune modifiche alla strumentazione per rispettare la scala.

Equazione 12: scale-up della velocità di flusso

Per esempio, se la velocità di flusso per una colonna analitica (5 µm, 4,6 mm x 50 mm) è pari a 1,5 mL/min, viene calcolata la velocità di flusso su una colonna preparativa (5 µm, 19 mm x 50 mm):

Scale-Up della Durata del Gradiente

In genere, non è necessario apportare nessuna modifica del gradiente durante lo scale-up se la velocità di flusso viene regolata in modo da mantenere la velocità lineare della fase mobile. Se le lunghezze delle colonne sono diverse, il tempo del gradiente deve essere calcolato per mantenere il tempo di ritenzione e separazione ottenuto su piccola scala.

Equazione 13: scale-up del tempo del gradiente

Per esempio, un segmento a gradiente lineare della durata di 5 minuti su una colonna analitica da 50 mm durerà 10 minuti su una colonna preparativa da 100 mm:

Prep Calculator

Anche i calcoli di scale-up di gradiente, flusso e massa possono essere eseguiti con il Prep OBD Columns Calculator un’applicazione di facile utilizzo che agevola tutti i calcoli di scalabilità da analitica a preparativa, includendo il carico di massa, il volume del sistema, le velocità di flusso, il consumo del volume di solvente, rapporti di frazionamento del flusso per la cromatografia guidata dallo spettrometro di massa e metodi UPLC a gradiente focalizzati per il trasferimento di metodi preparativi. È possibile accedere all’applicazione all’indirizzo www.waters.com/prepcalculator o tramite un software di purificazione basato su Waters come ChromScope.